评论:AFM可以揭示全球病毒RNA结构?

各种各样的单链病毒基因组结构图案已被证明指导关键步骤中扮演很重要的角色在许多病毒的生命周期1]。然而,大多数病毒基因组在长度超过1 kb,可用技术普遍缺乏能力研究全球长RNA分子的结构安排在一个实验中,导致很多RNA分子的结构随着时间的推移逐渐拼凑。为了解决这些问题,我们开发了一种新的高通量方法使用原子力显微镜(AFM)成像结合自动化分析工具来提取信息全球二级和三级结构的单链核酸(> 1 kb),主要集中在9.7 kb丙型肝炎病毒(HCV)基因组(2,3]。近年来,的重要性获得病毒生命周期的详细了解和指导病毒的分子结构过程反映在有针对性的对NS3蛋白酶抗病毒药物的发展,NS5B聚合酶,NS5A蛋白,还有,microrna - 122 (4]。我们的方法显示了巨大的希望,能够进一步完善病毒的分子细节过程的整个生命周期内的病毒,它可以帮助改进的抗病毒策略。

AFM成像和分析病毒RNA结构

最近,我们报道一个方法重复性良好形象的二级或三级结构单链RNA分子使用AFM [2,3]。特别感兴趣的是二级结构,表现出很容易观察到的图像可再生的特性。由于RNA折叠在很大程度上是分层(5,6),预计大多数的二级结构将被保留在三级结构的形成,所以安排的分析结构特点在这些分子应该产量结构相关的信息。使用这种方法,我们能够获得图像各种RNA分子的二级结构的大小从1.1 - 9.7 kb不等(2,3]。

后的发展这一新的方法,新的工具来分析图像中的分子的结构特点是必要的。为了解决这个问题,一系列的自动化开发了基于matlab算法提取RNA分子的分支领域架构的信息。值得注意的是,后确认存在线性相关的分子体积的核苷酸分子使用Gwyddion软件(2),我们开发了一个算法在MATLAB生成本地卷档案最长的端到端链骨架表示的识别分子作为一种分子检测领域,估计核苷酸包含在每个域的数量(3]。

丙肝病毒RNA域结构的识别

这些方法已经有效地用于识别著名的结构域缺失突变体的丙型肝炎病毒(HCV),包括内部核糖体进入位点(IRES),一个小域对应部分SLV-VI域,3 'x RNA,保利(U)地区(图1一个)。此外,我们发现了一个大bi-lobed域组成的核苷酸5声波测井和对应:上游地区除了~ 230核苷酸NS5B对应区域,表明这些地区的分子可能定位成一个单一的域结构(3]。这些发现表明AFM的能力来识别保守结构域存在于RNA分子,并提供合理的估计数量的核苷酸包含在每一个。此外,AFM能够识别新域名或检查一系列核苷酸的总体定位到单个域超微结构。类似的域名也可以观察到在整个长度丙肝病毒RNA (图1 b)。

RNA的识别能力域结构在我们的图片打开了许多令人兴奋的应用程序如何使用AFM技术RNA研究的未来。这些方法的长期目标是重建病毒生命周期的各个步骤,以便观察RNA领域参与这些步骤来收集情报,可以帮助我们对抗病毒感染。在短期内,许多改进实验方法和数据分析算法可以帮助使这一设想成为现实。

建立一个自动化的分子模式识别算法

我们的方法的最终目标是尽可能自动化数据分析过程来创建一个产量很高技术和有效地执行模式识别分子在我们的图片。这些模式识别过程可以用来排序的分子图像组根据他们的配置。它已被广泛报道,RNA可以折叠成各种各样的构象可以影响分子的活动(7]。这种类型的分析可以帮助识别主要和次要的RNA构象中观察到的图像。可能某些结构性转换可能病毒生命周期的不同阶段之间的直接转换,因此针对他们可能是一个可行的抗病毒策略。这些模式识别过程可以都致力于全球领域架构的分析RNA分子除了评估单个域的构象的灵活性。朝着这个目标,过程评估每个域的形状和方向应补充道。除了描述二级结构域,3 d算法评估的三级结构紧凑折叠分子Mg2 +缓冲也应该发展。从这种类型的分析复合模型详细描述这些分子构象的范围,可以生成可以采用。这些复合模型可以通过增加我们的模型与其他RNA结构预测方法。例如,可以作为约束获得的结构信息在生成计算预测的二级结构8,这些预测可以进一步证实了化学映射(9]。然后,复合的拓扑形状(s)的每个域可以用于预测二级结构如何安排在3 d空间。此外,3 d结构从x射线晶体学、核磁共振、低温电子显微镜,或x射线小角散射分析,通常更容易获得较小的RNA片段(1从AFM),可以使用结构模型生成一种轮廓的各个部分可以安装。

从全球结构到功能的作用

一旦全球的分子结构特征,我们可以转向理解每个结构组件的功能作用在调节病毒生命周期。其中一个最简单的方法是添加各种宿主和病毒蛋白质或辅助因子被认为与病毒生命周期的不同阶段,以观察它们与病毒RNA域的交互模式。使用丙肝病毒为例,各种细胞的机制因素结合IRES和改变其构象来增强或破坏内部发起的翻译可以调查(10]。除了描述这些复合物,形成的结构的动态绑定事件也可以可视化成像在缓冲溶液使用高速AFM (hsAFM), 1 - 2帧/ s的典型成像率(11,12]。而且,由于AFM也被广泛用来研究蛋白质的结构在本机或重组膜系统13- - - - - -15),这个方法也可以用来描述组件的安排膜膜相关复制酶复杂的分数与细胞表达HCV非结构蛋白(16]。自膜分数分离这些细胞已被证明能够合成RNA的体外复制化验,可以添加RNA直接可视化这些系统以负链中间体的合成所涉及的步骤以及新的基因组正链。等技术识别成像(17,18)或新开发BIXAM confocal-hsAFM [19)可以帮助识别蛋白质参与各种活动,在这个过程中。同时,病毒组装的步骤也可以追踪的可视化交互的丙肝病毒核心蛋白的RNA (20.]。除了识别所涉及的分子细节在病毒生命周期的各个步骤,这些方法也可以用作抑制剂检测筛选的这些过程可以大大帮助识别新的抗病毒药物。

引用

1. Cantara佤邦,et al。结构生物学的进展和前景大病毒rna。病毒Res.2014; 193:24-38。
2. Gilmore杰,et al . Nanoimaging ssRNA:丙型肝炎病毒的基因组结构揭示了原子力显微镜。j .纳米级。Nanotechnol。2014; s5。
3. Gilmore杰,et al。结构分析的单链RNA分子与原子力显微镜成像。:口服AY,口服ZB (eds) 3日Congr Int。能源Effic。能源过热。板牙。施普林格物理学学报、Oludeniz Fethiye / Mulga,土耳其;2016年。
4. Serranti D, et al。新的治疗慢性丙型肝炎:概述儿科医生。世界J Gastroenterol.2014; 20:15965 - 15974。
5. 布里P和Westhof e .层次结构和动力学的RNA折叠。为Biophys Biomol Struct.1997; 26:113-37。
6. Tinoco Jr我和法典c RNA折叠。J杂志。1999;293:271 - 281。
7. 施罗德R, et al . RNA折叠和组装策略。Nat牧师摩尔细胞Biol.2004; 5:908 - 919。
8. 马修斯和DH Seetin毫克。RNA结构预测:方法的概述。摩尔:沃克JM (ed)方法。杂志。2012;905:99 - 122。
9. 低JT和周公里。SHAPE-directed RNA二级结构预测。Methods.2010; 52:150 - 158。
10. 霍夫曼B和刘问:丙型肝炎病毒蛋白翻译:发展中抗病毒药物的机制和意义。肝脏Int.2011; 31:1449 - 1467。
11. Gilmore杰,等。单分子动力学的DNA-EcoRII蛋白复合物与高速原子力显微镜显示。Biochemistry.2009; 48:10492 - 10498。
12. 铃木Y, et al。视觉分析的共同解理型IIF限制性内切酶SfiI次秒级时间区域。Biophys J.2011; 101:2992 - 2998。
13. 恩格尔和Gaub他。膜蛋白的结构和力学。为Biochem.2008; 77:127 - 148。
14. 铃木Y等Microsc al.Scanning探测器。Nanosci。Nanotechnol。,2nd ed. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany; 2011.
15. 在Nano-Biology Takeyasu k AFM。Pan-Stanford出版社,日本;2015年。
16. 赖VC, et al。体外RNA复制由复制酶复合物孤立于subgenomic丙型肝炎病毒的复制子细胞。J Virol.2003; 77:2295 - 2300。
17. Dufrene YF AFM和Hinterdorfer p .最近进展分子识别研究。弗鲁格Arch.2008; 456:237 - 245。
18. 高桥H, et al .单分子解剖成像通过原子力显微镜和认可。拱Histol Cytol.2009; 72:217 - 225。
19. 铃木Y, et al。高速原子力显微镜结合倒置光学显微镜研究细胞活动。Sci Rep.2013; 3:2131。
20. Kunkel M, et al . Nucleocapsid-Like粒子的自组装从重组丙型肝炎病毒核心蛋白。J微生物学报。2001;75:2119 - 2129。