为抗菌测试比较评估的主要方法

文摘

细菌重视在诊所,那里的机制来对抗这些病原体的出现越来越多的发现一种物质与低成本、良好的药理特性和低毒性。它可以提到的主要微生物检测方法在文献中发现的细菌和真菌活动的三种类型:生物自动稀释和扩散。一般使用磁盘的技术扩散,腔扩散、琼脂糊、琼脂稀释法和肉汤稀释。这些分析是定量方法可以分类的影响。实验作为一种体外实验模型是竞争的结果。不同类型根据使用的方法,如扩散化验的媒介,能够影响化合物的氧化,有利于细菌膜的发展。目的:收集方法主要应用于抗菌测试和那些帮助与抗菌研究证实,在作者之间存在着比较方法应用的,但执行协议的意图是提供为每个引用试验。材料收集在主数据库,使用文章、书籍、技术手册、国际法规,所有最当前的上下文。结论:研究聚集七方法直接适用的抗菌测试,紧随其后的是五个测试,证实与抗菌结果可能制药的发展选择,如实验与果蝇megalogaster毒性试验;光动力疗法(PDT)和cytoprotection微生物重金属模型年代。

关键字

实验方法、抗菌,抗菌。

介绍

寻找有效的药物来对抗细菌感染已经彻底改变了研究的重点。波与抗生素的发现在1930年导致了死亡率大幅减少由微生物引起的疾病。众所周知,细菌耐药性是一种自然现象,后来青睐后,大规模使用抗生素对抗传染病,通常没有先前知识的微生物处理(1,2]。

考虑到细菌耐药性是一个事实,应该注意的是,这是一个巨大的遗传能力传输电阻到另一个细菌的遗传物质,除了事实获得抵抗药物作为治疗药物的作用发生的所有的时间3]。先验知识的微生物控制是非常重要的,和这些物质最敏感病原体将大大有利的减少这些耐药细菌5,33]。找到一个抗菌药物敏感性的主要方法概要文件被称为抗菌谱,一个测试通常在临床微生物学实验室(6]。

测定的灵敏度,有几种方法,但这些视为黄金标准,如琼脂稀释法和肉汤采用,可能存在不同的阅读形式与reazasurin或通过阅读吸光度比色法ELISA。虽然可以通过常规的实验室试验,尽管他们提供定量结果最低抑制浓度(MIC)定性技术,如磁盘扩散,尽管他们很容易执行不能预测麦克风,可能通过与一些媒体的交互可氧化的化合物(7,8]。

检测的主要方法的文献中发现的抗菌活性真菌和细菌的三种类型:稀释和扩散。琼脂扩散方法是定量方法的影响可以通过磁盘、分级和可以执行或模型技术。考虑到一些可以接触抗菌化验的方法,以及每个方法的理解能够证明生物活性的存在与否,这种材料的主要方法是用抗菌化验。

方法

我们使用文章、技术手册和标准在国家临床实验室标准委员会(NCCLS)描述不同类型的方法用于抗菌化验发现文献中到2018年。工作不是旨在比较而是作为执行每个方法的应用指南的作者,从如何准备为了提供知识的每个测试直到与目前的形式来看,阅读和引用的其他补充测试,证实了测试(9]。

细菌化验

确定最低抑制Concentration-MIC

Macrodilution

分析涉及macrodilution费力,少量使用复制(10,11]。最初,细菌样本应重新激活脑心浸液(BHI)中,孵化细菌学的烤箱在37°C 24小时[18]。孵化后,样品应该转移到试管包含5毫升的BHI肉汤,额外的孵化24小时37°C。培养液然后应调整适当使用分光光度计比色皿测定吸光度。通常使用的波长范围从420纳米到660纳米(9]。

开始试验,0.9毫升与不同浓度的培养基和0.1毫升细菌培养液调整(1到3 X 108 CFU /毫升)应该被添加到超小型电子管。的化验有重复的超小型电子管在37°C孵化24小时。在孵化后,视觉阅读显示细菌生长,由浊度(翻译18]。一个整除与循环在每个管,然后收集这样的材料是播种Mueller-Hinton琼脂为进一步孵化24小时37°C和阅读与其他结果证实9]。

阅读后孵化后,20μl呼吸0.01%的钠氧化还原指标应补充说,一个小时等待读取结果根据(10),蓝色染色表明细菌不活动和红色,细菌的活动。关于播种盘,潜伏期后,他们检查的观察表面细菌菌落生长(13]。

通过CIM Microdilution-determination内在活动的

化验,以确定的最低抑制浓度(14]细菌复活后在BHI标签规定的浓度,作为血统应该转移到3毫升的0.9%氯化钠溶液,然后摇动涡流器的帮助下形成一个暂停105 CFU /毫升,调整麦克法兰规模0.5%。然后,150μL剂将被添加到中包含1350μL嗨(10%),最后是1500μL,它应该被转移到每个标记埃普多夫或“微型离心管(15]。

产品依次是重达10毫克,可以根据要测试的浓度增加。然后,1毫升的二甲亚砜(DMSO-Merck、Marmstadt、德国)给出一个初始浓度稀释10毫克/毫升,然后在无菌水稀释浓度1024μg /毫升(14]。

与涡流搅拌后的解决方案包含BHI + 1500μL和培养液,100μL这个解决方案采用的是转移到每个盘子,然后它必须与100μL微稀释的产品进行测试,从第一个腔,直到倒数第二,保持最后的空腔自由稀释测试的产品,这在所有的重复,是需要保持控制微生物的生长,然后才能炉调整24小时37°C (16]。

CIM阅读可以通过添加20μL reazasurin每个。Reazasurin是染料,当它接触某种类型的微生物生活,改变其化学结构,使其颜色从蓝色基雷竞技网页版调(缺乏微生物)粉色(确认)有可行的微生物细胞的存在。如果研究者需要比较和/或确认杀菌或抑菌功能,煤层气的最低杀菌浓度测定可获得这些数据,注意的是,这应该是做过reasurin添加,亚文化与0.5μL每个培养皿中与标签板上的每个好/浓度在烤箱然后孵化24小时37°C。经过一段时间的24小时/ 37°C,每个浓度亚文化是阅读,如果有细菌生长或不12,17]。

目前ELISA设备是另一种形式的阅读中使用几个实验室,能够提供一种解释生成的数据可以提供图,保证测试的富达除了通知细胞生存能力,直接提供产品在多大程度上能够根据微生物,如50%的抑制细菌生长的抑制浓度在50%的微生物(IC50) [12]。

阅读在ELISA,需要产品稀释控制和不育控制。1350μL稀释控制,10%的BHI中等盐水+ 150μL将获得的,其目的是比较与微生物产品的稀释,稀释的盐水的产品,为了比较那些沉淀,除了生成一式三份的平均减少稀释的控制,这将导致精确的微生物的增长。豁免的不育控制提供信息的污染物不可行的可靠性测试(12,16]。

采用直接接触——抗生素活动修改效果雷竞技网页版

验证的修改影响抗生素对压力测试,提出的方法(14]。埃普多夫管包含sub-inhibitory浓度(MIC / 8), 10% BHI内容根据sub-inhibitory体积和浓度150μL细菌悬液(对应于10%的解决方案)。控制、埃普多夫管准备1.5毫升的解决方案包含1350μL BHI(10%)和150μL微生物的暂停。板是这个解决方案的数值通过添加100μL到每个。随后,串行执行稀释100μL抗生素丢弃在倒数第二。板块在37°C孵化24 h,然后20μL刃天青添加为确定可行的细胞染色(12]。

测定真菌的最低抑制浓度(MIC)

的化验确定真菌的最低抑制浓度可以用肉汤稀释法进行使用quadruplicate-labeled 96 -孔板,100μL double-concentrated sabouraud葡萄糖肉汤(CSD) +真菌暂停添加之后执行串行稀释100μL自然产物的浓度4096μg /毫升微稀释在头2048μg /毫升倒数第二2μg /毫升。最后并不是稀释,将控制真菌生长,此外,不育控制稀释介质的抗真菌的天然产品,应该执行,最好。板应该在37°C孵化24小时之后的最低抑菌浓度(CFM) ELISA (Termoplate后续阅读测试^®)设备启动,产生细胞生存能力曲线和IC50 [18]。防腐改性;测试描述(19与修改真菌的意思。

在这个测试验证自然产物的作用是否能够引起酵母一些二态性通过抑制菌丝的排放。首先,他们必须安装无菌和潮湿的微形态学室促进酵母的生长。在每个试管中应该包含3毫升,1毫升的解毒马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)耗尽导致酵母压力从而释放菌丝,+测试物质CSA / 2(8192μg /毫升),CSA / 4(4092μg /毫升)和CSA / 8(2048μg /毫升),然后倒进板。佩特里板与板由校准接种环(1μg)在两个平行的沟槽的已经凝固介质,然后由无菌显微镜盖玻片。孵化后24 h后(37°C)的文化被光学显微镜可视化。控制是为酵母生长的菌丝的排放是刺激的贫困中,以及控制商业抗真菌氟康唑,用于比较。根据[进行化验18)和符合的实验18)做了一些调整。

测量丝状结构的扩展

可能是必要的高分辨率显微镜最合适的光学模型(AXIO成像仪M2 - 3525001980 -蔡司-德国),耦合与禅宗计算机软件可以测量扩展达成的菌丝,分数后和减少的值。在每个幻灯片的照片将在所有领域的增长相比,控制和测试(18]。

磁盘扩散

首先,病毒被激活在使用的培养基通常是:脑心浸液BHI辛顿和琼脂穆勒。试管的4到5毫升的BHI转移借助一个吸管,细菌样本重新激活在孵化后24 h / 37°C。然后借助微生物的无菌拭子从培养液中复制到之前准备的无菌培养皿穆勒辛顿,涂片应重复的两倍多。这一步后,磁盘用于控制一个盘子和浸泡的测试物质应该使用另一个,如果有足够的空间可以在同一个板培养未来阅读(20.,21]。

根据执行的方法是(2由[],适应7,22)第一个化合物的解决方案准备在10%,5%,0.6%和0.3%。扩散试验应由最初称重测试物质并将其添加到被评估,根据浓度(14],最初1024μg /毫升以下为临床应用意义,10μL解决方案的测试在其各自的浓度在无菌滤纸片6毫米直径应该添加浓度计算。该方法的应用局限于快速增长的微生物,有氧或有氧兼性。目的是测试物质能抑制微生物的生长或防止其扩散。评价是相对与参考生物标准(积极控制)一般一个广谱抗菌素,欧元区或光环的生长抑制的周长测量从或磁盘,哪里有微生物的增长幅度和光环的大小相比,测试中发现的物质(10]。

扩散的精油

首先复活的线是通过接种之前在BHI 3.7%,后来他们播种与心浸液琼脂板——HIA孵化24/37°C。然后最低抑制决心——昏暗的石油应该重达50μg溶解在50μL 1:1 DMSO和进一步准备1:2系列稀释(50 - 1562μg石油)。复活期后,菌株应该转移和调整麦克法兰规模与等效浊度(105 CFU /毫升),后来借助无菌拭子或循环应该使种子在盘子的底部更合适的测试方法,通常合时宜。

数量100μL每个稀释的将被应用到培养皿在37°C孵化24小时。昏暗的被定义为最低抑制剂量每体积空气能抑制微生物的生长在一个封闭的系统12]。控制应准备与介质和溶剂作为测试,免费的油(23]。

活动修改抗生素的作用在体外通过气体接触(精油)雷竞技网页版

可能结合抗生素可以添加抗生素最好的磁盘,那么应该倒盘子和一卷50μL每个浓度将放置在盖子。三个斑块/微生物,使用抗生素磁盘和盖子的物质被放置在第一盘,第二把盖子上的抗生素和DMSO和第三只抗生素磁盘(24]。

板块在培养24小时37°C和阅读的帮助下测厚计结果,抑制晕的直径比的控制抑制光环直径的标准建立了(9]。而抑制晕直径的三个条件是衡量和评价确定统计学意义(23]。

扩散在腔

扩散化验使用蛀牙已经成为另一种抗菌化验,根据[描述的方法19]应该可溶性物质研究在DMSO然后蒸馏水获得解决方案所需的浓度。

文化媒体BHI和琼脂穆勒辛顿准备根据制造商。后的活化在BHI潜伏期的帮助下拭子中嵌入细菌样本与穆勒辛顿被重复复制到培养皿涂片的两倍多。因此穿孔的6毫米井执行使用套管,密封后与穆勒辛顿琼脂培养基。

每满50μL的测试物质浓度由麦克风,手术后板块采取24小时/ 37°C的孵化器。测量结果与测厚计考虑晕积极活动大于6毫米。最终结果是由直径的算术平均值相比,一式三份被抑制的晕晕的控制,可能抗生素用于比较(16,19]。

全球其他技术被研究人员

不锈钢圆筒

这在用于描述方法10),使用参考文献[11,25]。的技术包括应用不锈钢圆柱介质培养基下然后添加样品缸,在研究[4]200年μL药用植物提取物的,和没有论文报告与精油使用这种方法。作为一个积极的控制,细菌使用氯霉素(40μg /毫升;200μL)和水作为消极的控制。试验由两种细菌和真菌。

抗菌化验使用不锈钢钢瓶也提出的(25),他们适应了圆柱体在琼脂扩散的方法。细菌悬液在108 CFU /毫升,挑战200年μL乙醇提取物植物物种。最后是一个积极的控制,使用氨苄青霉素。

Light-mediated抗菌评价——光动力疗法(PDT)

light-mediated抗菌活动的评估分析被称为光动力疗法(PDT,能够导致失活的微生物。以第一次超过100年前,当奥斯卡拉布(27]报道草履虫caudatum吖啶盐酸盐的致命影响。

起初这项技术已经开发作为癌症的治疗选择,基于概念的无毒photosensitizing代理可以在某些局部优先组织和随后被光激活产生单线态氧和自由基的细胞的细胞毒性靶组织(27]。目前PDT一直用于治疗感染的范围除了消除微生物体外研究试验,表明其实用性作为辅助现有的消毒技术(4,28]。

化验的细菌应该更适用介质重新激活,然后10μL测试解决方案添加到空白(100μg /盘)一式三份。光敏性评估应该执行同时避免假阳性结果。而板暴露在UVA光线(5 W / m2, 315 - 400 nm,从欧司朗多乐士S蓝色UVA 9 W / 78 - g23灯,最大发射在350海里)2小时,另一个在黑暗中必须保持同一时期。排放流量应与数字紫外线计监测,以避免可能的排放值的变化,因此错误的结果。很快的盘子在37°C孵化24小时,其次是阅读的直径增长抑制区数字卡尺(26]。

积极的控制用于生长抑制氨苄青霉素(10μg /盘)。磁盘ethanolic解决方案(100%)的8-methoxypsoralein 8-MOP(10μg /盘)被用作控制光毒性的是积极的活动。然后用DMSO光盘(10μL /盘)被用来稀释溶剂产品作为负控制(26]。

Cytoprotection微生物模型对有毒金属

金属在体内的存在能够产生自由基,这在很大浓度造成严重损害DNA,诱导脂质过氧化反应,消耗的硫醇分组。植物修复仍在研究,以确定哪些植物可以用来删除包含,转让、稳定、使有毒金属无害的。第一个测试必须完成评估最低抑制浓度(方法采用描述)。然而,另一个M9矿产增长三介质可以被使用,例如BHI本身使用的最高方法论(9,12]。

CIM的结果后,埃普多夫应该包含sub-inhibitory浓度的样品(提取,没有被告知一些测试油),随着微生物必须标准化105 CFU /毫升M9三羟甲基氨基甲烷中有2%葡萄糖液。

然后添加到100μL含有介质的解决方案+微生物+提取然后采用氯化汞浓度(10毫米),采用微量应该培养48 h后在37°C。随后将潜伏期进行最低杀菌浓度,给出的最低浓度能抑制微生物的生长。皮下是由与HIA介质板,取出,处理好每个microdiluted HIA的板,然后孵化24小时37°C。煤层气是由最低浓度抑制细菌生长的能力,考虑到增长控制9,12]。

实验与果蝇megalogaster毒性试验

它们是苍蝇通常存在于水果和包含大约1500个物种在科12]。果蝇,在毒理学研究是一个新兴的模式系统。毒性试验是由生存的评价和负面geotaxia接触测试物质通过熏蒸。一般(Harwich应变)d .腹从国家获得物种证券中心、保龄球绿色哦。成年苍蝇应该转移到130毫升玻璃容器,包含滤纸。接下来,1毫升20%蔗糖应该添加到滤纸剩余的地板上瓶和大量的1毫升,5毫升和10毫升的容器盖子上的物质进行测试,最后苍蝇被添加在每瓶20。测试时间应控制在12小时光/暗周期和温度控制在26°C和相对空气湿度的±60%。果蝇的生存和geotaxia读数应该执行的时期3、6、12、24、36和48小时。同时分析毒性数据双向方差分析测试执行使用GraphPad Prism 6.0软件,然后执行一个图基多重比较检验。结论性的阅读可以看到通过死亡,赤字的运动时间间隔后曝光和那些没有出现任何可见的变化(29日,30.]。

提到的干扰方法

条件执行直接影响易感性的扩散和稀释方法,因此需要了解实验的条件和相同的标准化根据有关规定,提供重要的因素如(10]:

文化媒介:培养基是其中一个因素可以影响细菌生长,因此未来的结果。水泡的形成可能会影响药敏,进一步阻碍了评估,例如,那些通过琼脂扩散不佳,如多粘菌素(31日]。

氧的可用性:在研究[10),报告,研究[32),观察到的关系,氧的可用性可以影响有氧的乘法,厌氧或兼性微生物。

移液错误:校准的吸管的缺乏可能干扰量,将用移液器吸取,因此评估的准确浓度的物质,导致作者使用的一式三份或一式四份,这将减少误差。

光盘:琼脂的厚度和均匀性好的决议的结果至关重要,必须严格控制它的体积,以避免形成表面条纹和泡沫32]。中使用的光盘采用化验可能会影响结果,如果他们不是一个更大的大小或小于6毫米;他们必须做绝育手术10]。

培养液的校准:每个菌株用于每个测试分别提出了独特的特征,有一个标准遵循一个完美的孵化,每个菌株都有一个孕育时间大于另一个,支持经济增长不同的营养物质,因此CFU的用量无法逃脱的标准,比如麦克法兰规模0.5%。

结论

下的“筛选”主要方法用于抗菌活性被外部化,提供深度知识准备和分析结果。突显出确凿的测试来说明行为的化合物,此外的先验知识,如何选择一个好的制药配方化合物发现的使用。的工作提供足够的物质援助在寻找方法可以应用在抗菌活性和以前的毒性,与当前上下文和后被认为是黄金标准。最后,重要的是要评估干扰因素,建立参数根据需要的方法用于给定的目标。

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