关键字 |
| 蛋白酶,蛋白酶功效,dermatophytic真菌 |
介绍 |
| 真菌产生蛋白酶的不同。大多数真菌如链格孢属、镰刀霉,Absidia、毛霉、曲霉属真菌,霉菌的侵蚀,青霉菌,collectrotricum,枝孢属,Curvularia,根霉、木霉属、Morcella,和Dematium等表明蛋白酶活动[1]所有酶都是蛋白质,利用活细胞,负责许多细胞的代谢过程。它们可以被细胞内或细胞外。真菌产生胞外酶(s)为了打破他们能吸收的大分子成微分子[2]。真菌需要含碳物质,如糖的能量来源,都需要氮含复合物质构建蛋白质和其他重要的化合物。每个真菌产生不同类型的酶的化学性质取决于主机[3]。此外,一群可同时分泌酶针对多种营养物质。蛋白酶是一组蛋白酶和肽酶。蛋白酶催化蛋白质分子的水解成更小的碎片。肽酶水解多肽片段[4]。 Based on the active site moiety, the proteases are of following major types [5] . proteolytic enzymes are required by all organisms for nutrient acquisition. However, pathogenic microorganisms often secrete enzymes of this class that may aid in their virulence by other means, including tissue destruction and modulation of host defense responses. It is therefore important to investigate the production of these enzymes by known pathogens [6] . it was described that, the protease identified and characterized from A. niger, involved in its proteolytic processing in the secretory pathway, recognizes dibasic amino acid motifs and removes the propeptide from the newly synthesized proteins. This study also focused on proteins containing only one basic amino acid as cleavage site for propeptide removal [7] . protease producing strain Aspergillus niger has been isolated from local soil samples and enzyme production was optimized under submerged conditions.The molecular weight of the enzyme determined by SDS-PAGE was found to be 38 kDa. The enzyme acted optimally at pH 10 and 50°C. It was thermo stable and retained full activity even at the end of 1 hour of incubation at 40°C [8] |
材料和方法[9-22] |
识别和接种真菌菌株 |
| 不同的真菌文化中被确认的基础上文化和微观研究。这些孤立的真菌是曲霉菌香薰,镰刀菌素sp,黑曲霉Curvularia sp,毛霉菌sp。孤立的真菌菌株的纯培养是维护在PD的培养基配方与链霉素28°C在研究过程中。 |
生化测定蛋白酶活动 |
| 蛋白酶真菌的培养基配方的准备活动 |
| 为了收集不同真菌分泌的胞外蛋白酶的文化中,真菌与明胶生长在马铃薯葡萄糖肉汤。增长72 h后PD汤含有真菌菌丝体是过滤去除真菌孢子和菌丝。所有5真菌汤过滤的帮助下注射器过滤器使用Muktell滤纸(德国)。滤液收集在微型离心机管并将其保持在4°C到使用。这些滤液的supematants被用作酶来源。 |
| 估计总蛋白 |
| 每个部分的蛋白质含量估计用洛瑞的方法[9]的方法通过使用牛血清白蛋白作为标准。 |
| 蛋白酶活性 |
| 蛋白酶活动1%酪蛋白溶液在250毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液pH值8.5被选为基质。离心后,0.5毫升的上层清液和蛋白质之前评估。吸光度是记录和蛋白酶活性的汤是用BSA的标准曲线计算。蛋白酶活性的真菌肉汤是化验以同样的方式。具体活动是表示为单位活动的数量每毫克的蛋白质。 |
部分纯化的酶 |
| 硫酸铵沉淀 |
| 固体硫酸铵添加到原油提取30 - 70%饱和度(Laemmli 1970)。收集的离心沉淀,溶解在最小体积的250毫米Tris-Hcl缓冲区(pH值8.5)和酶活性估计在每一个分数。 |
| 凝胶过滤色谱法 |
| 凝胶过滤色谱法是由使用35 x 3厘米列由硅胶(60 - 120目SRL化工、印度)。硅胶是称重和蒸馏水补充道。然后它被允许膨胀起来。一旦肿了起来,倒在列和列可以安定下来,这样可以形成的。后准备的列是平衡与100毫升冷冻缓冲区来维持的pH值列当薄薄的一层缓冲出现在列,1毫升的示例加载并被允许进入列。80毫升的洗脱开始冷冻250毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液pH值8.5和24分数每个收集3毫升。这些分数被受蛋白质估计和酶活性和蛋白质含量在每个分数计算使用标准曲线。直到使用分数被保持在4ºC。 |
描述不同真菌来源的蛋白酶 |
| SDS——页面(钠十二烷基聚丙烯酰胺凝胶电泳) |
| 真菌培养基滤液35μl混合15μl样品缓冲。样品缓冲由625毫米三基地,2% SDS、10%甘油100毫升蒸馏水和pH值调整到6.8,1 n盐酸。这个缓冲区一些晶体的溴酚蓝是为了找到样品。样品在微型离心机离心10分钟和上层的50μl加载样品在凝胶。在第一个20μl蛋白质标记也被加载。这种凝胶是停止运行一次溴酚染料达到底部的凝胶。 |
| 活动染色(Zymography) |
| 运行后,凝胶的凝胶被录音带。这种凝胶是活性染色根据之前。为此,凝胶放在1%酪蛋白的解决方案没有搅拌30分钟在4°C。30分钟后,酪蛋白溶液的凝胶是放在一个平台振动器(雷米、印度)30分钟rt,然后丢弃酪蛋白溶液和凝胶与蒸馏水清洗三次。洗后凝胶放在10%柠檬酸溶液瓶10分钟。凝胶用蒸馏水洗净,染了30分钟了。考马斯亮蓝g - 250的解决方案。这0.25%的考马斯亮蓝g - 250乙醇:乙酸:水(%:1:4)。染色是在不断搅拌。这种凝胶是用蒸馏水洗净,使退色甲醇:乙酸:水(4.2:0.8:5)解决方案在不断搅拌。使脱色后,清楚乐队在蓝色背景代表蛋白酶活性。 |
结果与讨论 |
| 在目前的研究中五种真菌菌株被识别和筛选蛋白酶的蛋白质含量和活动。原油提取所有的5个样品受到“盐”和3种不同的分数是收集的每一步。蛋白质含量和酶活性是检查每个应变三分数。表1总结了总蛋白质含量以及相应的蛋白酶活性高的沉淀分数5真菌文化。蛋白酶活动所示的蛋白质降解量每分钟(BSA)。 |
| 镰刀菌素物种分数7 - 10和12 - 14发现最大的蛋白质含量和还显示酶活性最高。表2代表了凝胶过滤的镰刀菌素sp.由图1进一步解释。 |
| 在Curvularia sp,分数6 - 7,10 - 14和15 - 17显示最大的蛋白质含量和酶活性最高。这些分数都汇集在一起,sds - page。表3代表所有凝胶过滤的Curvularia sp.和图2显示图形。 |
| 来自烟sp.与上述两种不同,显示不同的模式在凝胶过滤。如表4和图3被分数1 - 4显示大量的蛋白质含量和酶活性但这些分数不能用于进一步的研究,因为它可能包含一些残留的分数可能是由于不当使用前洗的列。而分数11 - 13、16 - 17和22日至23日受到进一步的研究。 |
| 根据A.niger凝胶过滤的状况。,it was observed that fractions 7-9, 11-13 and 14-16 had maximum protein content and highest enzyme activity as shown by the fig.4 and table 5. |
| 在毛霉菌sp,分数7 - 8月19 - 21日显示,最大的蛋白质含量和酶活性最高。表6和图5澄清事实,因此这些分数都汇集在一起,进行进一步的研究。 |
摘要和结论 |
| 五真菌菌株显示大量的胞外蛋白酶活性的单位总蛋白质含量。通过测试的所有原油提取酶活性,镰刀菌素sp.发现显示最高的活动而毛霉菌sp.显示最低的。然而,培养基配方后不同的数量增长和培养液的大小也不同,原油提取的蛋白酶活动不可能相关。然而,一旦培养基配方使用硫酸铵沉淀,沉淀物是resuspended在已知数量的缓冲,蛋白酶活动可以相比。 |
| 发现没有相关性之间的洗脱模式五种真菌样本。此外,蛋白酶活动出现在一个或多个彼此遥远的分数。这表明存在一个以上的蛋白酶和分子量的影响。 |
| 这个解释被zymography的发现加强,不止一个乐队出现在所有给定的样本。此外,乐队的模式不同于彼此表明没有生产类似真菌菌株的蛋白酶在给定的条件。 |
| 真菌的研究支持这个概念是一个很好的来源的细胞外酶特别是蛋白酶。然而,这还需要进一步的研究这个方向的描述之前,这种蛋白酶的此类产品可用于商业。 |
| 图7显示了选定真菌的活性染色文化。明确区域指示蛋白水解活性。分子量与蛋白质标记相比,在相同的加载凝胶的浓度。道, |
| 1。镰刀菌素sp。 |
| 2。来自烟sp |
| 3所示。Curvularia sp。 |
| 4所示。毛霉菌sp。 |
| 5。黑曲霉 |
表乍一看 |
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数据乍一看 |
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引用 |
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