从hiv阳性患者和义齿口炎病变中分离的不同白色念珠菌样本毒力的比较:体外和体内试验

费尔南达Freire^＊， Felipe de Camargo Ribeiro, Damara da Silva Ávila, Cristiane Aparecida Pereira, Juliana Campos Junqueira, Antonio Olavo Cardoso Jorge

联合国环境规划署大学科学技术研究所生物科学和口腔诊断系，Estadual Paulista, São José dos Campos，巴西

*通讯作者:: 费尔南达Freire
生物科学与口腔诊断系;科学技术学院
联合国环境规划署-圣保罗州立大学，São José多斯坎波斯，巴西
电话:+55 12 39479033
传真:+55 12 39479010
电子邮件: (电子邮件保护)

收到日期:12/12/2016;接受日期:30/01/2017;发表日期:07/02/2017

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摘要

本研究的目的是评价白色念珠菌引起的念珠菌病的体内外毒力。本研究使用4个临床样本，其中2个来自hiv阳性患者(14/60)，2个来自假牙口炎(DS)病变(32/62)，1个参考菌株。初步评价了溶血素、脂肪酶、磷脂酶和蛋白酶的体外分泌情况酶；以及细胞表面的疏水性。随后，对小鼠进行免疫抑制，并接种白色念珠菌悬液。六天后，这些动物被安乐死，舌头被取出进行宏观和组织学分析。所有样品均产生毒力因子;然而，艾滋病毒阳性患者的样本毒性更强。宏观分析，各组均有念珠菌病病变，各组间差异无统计学意义。从hiv阳性患者分离的白色假单胞菌接种组的酵母和菌丝数量更高(p=0.0036)，组织损伤更大(p=0.0016)。炎症浸润在14株与62株之间、62株与32株之间均有统计学差异(p<0.0001)。基于这些结果，可以得出结论，来自hiv阳性患者的临床样本毒性更强。 The experimental model of this work was essential to increase our understanding of the pathogenicity of C. albicans.

关键字

白色念珠菌口腔念珠菌病，免疫抑制，实验感染，小鼠模型

简介

真菌感染在口腔中主要是由白色念珠菌物种(1，2]，约占总数的70%假丝酵母在口中分离的[2］．定植和感染白念珠菌酵母是由生物膜的形成介导的，该生物膜由胚孢子、假菌丝和埋在细胞外聚合物质中的菌丝的异质混合物组成，这些物质形成通道和孔隙，并表现出与浮游念珠菌不同的表型特征。生物膜可维持细胞的完整性，防止细胞被吞噬，限制抗真菌药物的扩散[3.］．此外，其他毒力特征白念珠菌，如黏附粘膜细胞，从单细胞酵母转化为丝状形式的能力，以及水解细胞外的分泌酶，在宿主组织入侵和解放的过程中被利用营养物质,使白念珠菌一种在不同宿主部位引起广泛感染的病原体[4］．

白念珠菌生物膜常与假牙口炎的发生有关[5，6］．义齿口炎是一种常见的炎症反应，病因多因素，通常与念珠菌种类有关，特别是白念珠菌，因其毒力强，能粘附口腔形成生物膜组织和假牙表面[7］．

在HIV患者中，口腔表现是最重要和最早的指标。HIV感染有7种主要症状:口腔念珠菌病、毛状白斑、卡波西肉瘤、牙龈线状红斑、坏死性溃疡性牙龈炎、坏死性溃疡性牙周炎和非霍奇金淋巴瘤。50%的艾滋病毒感染者和80%的艾滋病患者都有上述特征[8］．念珠菌病是由于白念珠菌［9］．念珠菌感染有四种形式，包括假膜性念珠菌病、红斑性念珠菌病、增厚性念珠菌病和角性唇炎。已注意到患者可能存在上述一种或多种组合[8］．上述四种念珠菌病均存在低CD4计数[9］．

小鼠动物模型在实验性念珠菌病的开发中是有用的，因为它没有假丝酵母作为微生物群的组成部分和针对这种微生物的二次免疫反应。此外，这种动物容易大量获得，免疫系统与人类更相似，维护成本更低[10，11］．

分析临床分离株的重要性在于它们的毒力因子可能不同。因此，进行了详细的刻画白念珠菌毒力因子不仅对详细了解感染过程是必要的，而且对产生新的和更有效的抗真菌化合物也是必要的[12］．

因此，本研究的目的是评估不同毒力因子的产生在体外并比较临床分离株引起的念珠菌病白念珠菌在实验小鼠模型中。

材料与方法

伦理委员会

UNESP科学技术研究所动物研究伦理委员会根据第11/2014号议定书- CEUA/ICT-CJSC-UNESP批准了这项研究。

微生物

4个临床样本白念珠菌其中2例来自HIV患者(14例和60例)，2例来自其他假牙口炎患者(32例和62例)。一个参考菌株白念珠菌(ATCC 18804) (American Type Culture Collection-ATCC)也被纳入本研究。临床样本是先前分离和鉴定的[13，14]，并与参考菌株一起保存在我们实验室的库存收集-80°C。

在体外毒性测试

为了评估酶活性和溶血活性，每个样品都在Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA;Difco, Le Pont de Claix, France)，并在37ºC下孵育24小时。接下来，将样品等距地接种在每种酶所研究的特定培养基上(~6 mm)。每个样品测试8次，培养皿在37℃下孵育2-7天。

使用两种培养基混合评估蛋白酶分泌[15］．经高压灭菌后的A培养基由C组成₆H₁₂O₆, KH₂阿宝₄, MgSO₄(Labsynth, Diadema, SP，巴西)琼脂(Difco, Le Pont de Claix，法国)和蒸馏水。经过滤灭菌的培养基B由牛白蛋白V、核黄素、烟酸、盐酸硫胺素(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)和蒸馏水组成。

磷脂酶的产生[16]，用含NaCl、CaCl的SDA进行检测₂(Labsynth, Diadema, SP，巴西)，无菌蛋黄乳剂，不添加碲酸钾(Himedia，孟买，印度)。

脂肪酶活性[17通过在含有蛋白胨(HiMedia)的培养基上生长样品来确定₂、NaCl (Labsynth)、琼脂(Difco)、Tween 80 (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)和蒸馏水。

溶血活性[18采用SDA (Difco)补充C₆H₁₂O₆(Labsynth)和新鲜的羊血(Cecon, São Paulo, SP, Brazil)。

培养后测定酶活性和溶血活性。测量菌落直径以及菌落和沉淀区(Pz)的总直径，并使用Price等描述的方法对酶活性进行评分。[16］．Pz值表示菌落单独与菌落直径加上降水带的比值。结果分为无活性(Pz=1)、中度活性(0.64≥Pz<1)和强活性(Pz<0.64)。

细胞表面疏水性[19通过在每个样品的悬浮液中加入1ml二甲苯(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)来测定假丝酵母以不含二甲苯的悬浮液为对照。在37°C的水浴中孵卵40分钟后，仔细收集下水相，并在520 nm直接通过分光光度读数测量。CSH以百分比表示酵母通过公式[(C0) CH)/C0] × 100来确定，其中C0是控制管的结果，CH是试管的结果。每个样品重复测试三次。高度疏水的样品值大于50%，中度疏水的样品值在20 - 50%之间，亲水的样品值小于20%。

口腔念珠菌病诱导

真菌接种剂制备:在进行口腔念珠菌诱导前，我们用棉签在小鼠口腔内采集，撒在Sabouraud葡萄糖琼脂上，37℃孵育48 h，以验证念珠菌是否存在。5个样品在SDA (Difco)上接种，37℃孵育24小时。接下来，每个样品在酵母氮基液体培养基(Himedia, Mumbai, India)中添加100 μM葡萄糖(Vetec，里约热内卢de Janeiro, Brazil)中培养，37℃孵育18小时。离心收集细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次。将颗粒重新悬浮在10ml PBS中，并在Neubauer室(Laboroptik GMBH, Bad Homburg, Germany)计数后调整至108个活细胞/ml。

实验动物:50只成年雄性小鼠(Mus musculus, Albinus, Swiss)，体重30 - 60克，口腔内无念珠菌，被纳入研究。食物和水源自由取用，动物饲养在可容纳5只动物的通风架内。以10只动物为研究对象，对白藜芦醇致念珠菌病进行了实验性研究白念珠菌标准样本，以及40只实验动物所研究的假丝酵母菌诱发的临床分离株，分为组:14、60、32和62(每组n=10)。

Takakura等人描述的方法[10]用于诱导实验性念珠菌病。简单地说，用2次皮下注射泼尼松龙(Depo-Medrol, Laboratórios Pfizer ltd .)对动物进行免疫抑制。， Guarulhos, SP，巴西)，在感染念珠菌前1天和感染后3天剂量为100 mg/kg体重。四环素氯化物(Terramicina, Laboratórios辉瑞有限公司。，Guarulhos, SP, Brazil) was administered in the drinking water at a concentration of 0.83 mg/ml beginning 1 day before infection and maintained throughout the experiment. Intramuscular injection of chlorpromazine chloride (10 mg/kg of body weight; Amplictil, Sanofi Aventis, Suzano, SP, Brazil) was used to sedate the animals.

无菌棉签(Absorve, Cral, São Paulo, SP, Brazil)浸泡在白念珠菌用悬浮液接种镇静小鼠，用棉签在舌背摩擦1分钟，诱导口腔念珠菌病。

的安乐死在第一次免疫抑制后7天内进行。这个手术是通过注射过量的麻醉剂来完成的。然后取舌进行宏观和微观分析。

小鼠舌背念珠菌病的宏观分析:使用立体显微镜观察舌背念珠菌病的特征性病变(Zeiss, Göttingen，德国)。为了量化每个舌背的病变数量，评分从0到4:0，正常;1、白色斑块在表面的20%以下;2、白色斑块覆盖21% ~ 90%的表面;3、表面91%以上有白色斑块;4、表面覆盖91%以上的厚白色斑片状伪膜[10］．

小鼠舌背光学显微镜:为了对病变进行显微分析，舌体在10%福尔马林中固定24小时。石蜡包埋后，切取5 μm组织切片，用苏木精-伊红(HE)和周期酸-希夫(PAS)染色。使用光学显微镜(Olympus, CX41, Tokyo, Japan)在X400放大倍率下分析念珠菌病的存在。

通过分别计数PAS和HE染色的组织学切片上的菌丝和上皮病变数量来量化念珠菌病病变。对于每个染色剂，为每只动物随机选择两个组织学切片。在每个组织学切片中，按前后方向分析25个组织场，结果共分析50个组织场。

根据Junqueira等人的方法定量酵母和菌丝的存在[20.]，将以下分数归因于组织学领域:1,1 ~ 5个酵母/菌丝;2、6 ~ 15个酵母/菌丝;3、16 ~ 50个酵母/菌丝;4，超过50个酵母/菌丝。为了进行统计分析，每只动物从50个组织学领域获得的得分中位数被确定。通过计算存在上皮病变的组织学场数量来评估组织病变的强度，如剥落、丝状乳头缺失、分层缺失、上皮增生、胞吐、海绵样变、棘松化、角化过度、基底层紊乱和上皮内微脓肿发展。确定每只动物中有上皮病变的组织学切片数量的平均值进行统计分析。

宏观和微观分析均由一名盲眼研究人员进行。

统计分析

使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad software, Inc, La Jolla, CA, USA)对获得的数据进行统计分析。结果采用Kruskal-Wallis和Dunn多重比较(p≤0.05)检验。

结果

在体外毒性测试

所有样品都产生了所评估的毒力因子在体外（表1)．pz值最低的样本，表示更大酶活性是白念珠菌60白念珠菌14例，都是从hiv阳性患者身上分离出来的。

毒力因子	白念珠菌
毒力因子	白念珠菌(写明ATCC)	白念珠菌60	白念珠菌14	白念珠菌32	白念珠菌62
溶血素¹	0.47±0.04^AB	0.46±0.05^AB	0.41±0.03^AB	0.52±0.08^B	0.50±0.07^AB
脂肪酶¹	0.27±0.04^AB	0.24±0.04^B	0.27±0.05^AB	0.31±0.07^AB	0.32±0.08^B
磷脂酶¹	0.71±0.08^一个	0.67±0.02^AB	0.61±0.05^B	0.68±0.02^一个	0.70±0.03^一个
蛋白酶¹	0.45±0.06^一个	0.33±0.03^B	0.34±0.03^B	0.44±0.04^交流	0.39±0.06^C
CSH²	29.79±4.08^一个	47.13±6.13^B	48.84±3.40^B	39.15±3.23^C	40.37±3.70^C

¹酶促和溶血分类:阴性(Pz=1)、中活性(0.6≥Pz<1)和强活性(Pz<0.64)。
²细胞表面疏水性(CSH)分类:菌株亲水(<20%)，中等CSH(20-50%)和高CSH(≥50%)。每种白色念珠菌之间毒力因子表达的显著差异用大写字母表示(p值<5%，Kruskal-Wallis和Dunn's多重比较检验)。

表1:白色念珠菌毒力因子的分布。

白念珠菌60组在脂肪酶和蛋白酶的分泌中表现出较高的酶活性。但蛋白酶分泌量与ATCC 18804株相比差异有统计学意义(p=0.0001)。白念珠菌样本32 (p=0.0001)白念珠菌样本62 (p=0.0382)。

白念珠菌14种酶活性较高，其中溶血素和磷脂酶活性较高。磷脂酶分泌量与ATCC 18804株差异有统计学意义(p=0.0019);白念珠菌样本32 (p=0.0497)和白念珠菌样本62 (p=0.0105)。

对于CSH,白念珠菌14被认为更疏水，以及白念珠菌60.之间有显著差异白念珠菌14和ATCC菌株(p=0.0001)，白念珠菌32 (p = 0.0005);而且白念珠菌62 (p = 0.0028)。为白念珠菌60，与ATCC株比较差异也有统计学意义(p=0.0001);白念珠菌样本32 (p=0.0052)，和白念珠菌样本62 (p=0.0234)。

从假牙口炎病变中分离的样品32和62也表现出比ATCC菌株更高的磷脂酶、蛋白酶和CSH活性。但两组间蛋白酶分泌差异有统计学意义白念珠菌样品62与ATCC株比较(p=0,0284)。之间的CSH也有统计学意义白念珠菌样品32和ATCC菌株(p=0.0008)之间白念珠菌样品62和ATCC菌株(p=0.0002)。

宏观分析白色念珠菌舌背感染

宏观分析结果表明，各组均接种枸杞多糖悬液白念珠菌，舌背有念珠菌病损害(图1)．宏观分析中分配的得分中值在所有组中是相同的。临床分离株得分较高白念珠菌但两组间无统计学差异(p=0.7313) (图2)．

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图1:念珠菌病病变的宏观分析。图像显示ATCC 18804菌株(a)和临床分离株14 (b)， 60 (c)， 62 (d) e C32 (e)的病变，显示出现白色区域(▲)和乳头状萎缩(↓)。

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图2:ATCC 18804株感染组和临床分离株舌背宏观检查得分和中位数。(克鲁斯卡尔-沃利斯= 0.7313)。GraphPad Prism 5软件(GraphPad software, Inc, La Jolla, CA, USA)用于创建此艺术品。

显微分析白色念珠菌舌背感染

显微镜分析通过定量酵母和菌丝、上皮变化和结缔组织炎症浸润程度进行。

在念珠菌病病变中，酵母和菌丝局限于舌背角蛋白层，主要集中在单圆锥乳头，有时在舌背周围。当念珠菌浓度较高时，可见上皮细胞中存在多形核白细胞，形成上皮内微脓肿，结缔组织中存在炎症浸润。

在每只动物的50个组织学领域中，对酵母和菌丝的存在进行了量化。该小组接种临床分离株白念珠菌来自hiv阳性患者(14例和60例)的酵母和菌丝含量较高(图3)，组间差异有统计学意义(p=0.0036)，表明这些菌株具有较高的致病性(图4)．

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图3:ATCC 18804株感染小鼠舌背矢状切口及临床分离株。在ATCC 18804菌株(a)和临床分离株14 (b)， 60 (c)， 62 (d) e C32 (e). PAS中角蛋白(↓)和上皮(▼)中的酵母和菌丝;放大:200 x。

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图4:从ATCC 18804菌株和临床分离株的50个组织学场中分析菌丝和酵母数量的得分和中位数。(Kruskal - Wallis=0.0036)。数值后面不同大写字母表示两组之间有显著差异。GraphPad Prism 5软件(GraphPad software, Inc, La Jolla, CA, USA)用于创建此艺术品

对上皮细胞的变化进行定量分析，发现上皮细胞有许多损伤，如剥落、丝状乳头丧失、分层丧失、上皮细胞增生、胞吐、海绵样变、棘松化、角化过度、基底层组织紊乱和上皮内微脓肿发展。临床样本白念珠菌hiv阳性患者(14例和60例)比其他组显示出更多的组织损伤(图5)，具有统计学差异(p=0.0016) (图6)．在来自假牙口炎病变(32和62)的临床样本中，观察到其他组(图5)．

图5:ATCC 18804毒株和临床分离株感染小鼠舌背的矢状切口，在ATCC 18804毒株(a)和临床分离株14 (b)、60 (c)、62 (d)、C32 (e)中显示轻度和中度炎症浸润。可以观察到所有研究病变的存在:剥落(f)、丝状乳头缺失(g)、分层缺失(h)、上皮增生(i)、胞吐(j)、海绵样变(k)、棘松化(l)、角化过度(m)、基底层紊乱(n)、上皮内微脓肿发展(o)。HE;放大:400 x。

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图6:ATCC 18804株和临床分离株感染小鼠舌背念珠菌病微观病变中上皮改变和中位数的数目(Kruskal - Wallis = 0.0016)。数值后面不同大写字母表示两组之间有显著差异。GraphPad Prism 5软件(GraphPad software, Inc, La Jolla, CA, USA)用于创建此艺术品

炎症浸润评分分配结果在14组与62组之间，62组与32组之间均有统计学差异，p<0.0001 (图7)．

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图7:在感染ATCC 18804菌株和临床分离株的小鼠舌背的显微镜下念珠菌病病变中观察到结缔组织炎症浸润程度的评分和中值(Kruskal - Wallis<0.0001)。数值后面不同大写字母表示两组之间有显著差异。GraphPad Prism 5软件(GraphPad software, Inc, La Jolla, CA, USA)用于创建此艺术品。

讨论

假丝酵母共栖于人类口腔的30-50%。然而，在某些条件下，共生真菌可以成为条件致病菌并引起表面和/或全身真菌病。口腔念珠菌病作为最常见的机会性感染，由于器官移植患者、hiv感染者、正在接受治疗的患者等损害宿主的数量不断增加，其发病率在过去几十年里迅速上升化疗或因滥用抗生素[21，22］．

Pereira等人[14隔离、量化、识别和比较机会主义微生物来自假体贴合表面、硬腭和佩戴可摘上颌假体的个体的口腔冲洗液，其中(50)例为假牙口炎，(50)例为无假牙口炎。白念珠菌两组中最常分离的酵母菌种类是c . tropicalis而且c . glabrata．在一个类似的研究中，马丁斯等人。23]，分离并确定口腔发病率假丝酵母在牙齿修复中。口腔拭子从66例患者的义齿中采集白色念珠菌是最常分离的微生物(63%)。因此，本研究使用了两种白念珠菌义齿口炎损伤的临床分离株，验证其在口腔念珠菌形成中的毒力。

Junqueira等人。[13]从60名血清阳性HIV患者中收集念珠菌样本，经API20C系统鉴定，发现最常见的分离种为白念珠菌(51.56%)其次为非白色患者假丝酵母spp。(43.73%)。结果表明，这些菌种对治疗念珠菌病的重要抗真菌药物氟康唑和两性霉素B具有耐药性。在Maheshwari等人进行的类似研究中[24]，从88例HIV阳性病例中共分离到128株念珠菌，鉴定出7种不同的念珠菌种。白念珠菌最常见的分离种(50%)。Gemaque等人。[25]调查了Pará联邦大学大学医院107名患者的传染性传染病患病率，并证实结核病是最常见的疾病(40.2%)，其次是艾滋病(32.7%)。这些患者中最常见的损伤是牙周病(57.5%)和口腔念珠菌病(22.8%)。柏柏利语和努海姆语[26]在一项为期两年的描述性横断面研究中，50名患有艾滋病毒感染进行了评估。所有患者均表现出至少一种口腔症状。最常见的口腔病变是假性膜性假丝酵母菌病，占76%(38/50)，其次是牙周病34%(17/50)，疱疹性病变和毛状白斑各占10%(5/50)，牙龈炎8%(4/50)，口腔溃疡8%(4/50)，卡波济肉瘤6%(3/50)，非霍奇金淋巴瘤2%(1/50)。因此，也被用于临床白念珠菌从HIV阳性患者身上提取样本，以验证其毒性在体外在口腔念珠菌病形成过程中，将其毒力与假牙口炎损伤样本及标准菌株ATCC 18804进行比较。

从无害的共生生物到有毒的共生生物的转变致病源归因于广泛的选择性表达的毒力决定因素[27］．在本研究中，我们评估在体外毒力的五种不同属性:分泌溶血素、脂肪酶、磷脂酶和蛋白酶;和CSH。所有研究的样本都产生毒力因子，但从HIV患者中分离出的样本被认为比ATCC和从退行性椎体病变中分离出的样本毒性最强。这些样品表现出很强的酶活性，被认为是最疏水的。

对于念珠菌属的成员来说，粘附于宿主组织是定植和随后感染所必需的，被引用为感染过程的第一阶段[28］．本研究中研究的细胞外水解酶被认为在念珠菌过度生长中起着重要作用，因为这些酶促进了粘附、组织渗透和随后的宿主入侵。蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶可降解几种重要的生理底物，如白蛋白、免疫球蛋白，磷脂而皮肤蛋白质，从而促进上皮细胞膜的破裂，使菌丝在感染过程中穿透细胞质[29，30.］．除水解细胞外酶外，还对样品的溶血能力进行了评价白念珠菌在富含血液的培养基中。在这种培养条件下，所有白念珠菌样品显示出很强的溶血活性。白念珠菌破坏红细胞获取铁产生溶血素的物质。此外，溶血素的分泌和铁的获取促进菌丝侵入和播散性念珠菌病的发展[4］．

本研究评估的另一个毒力因子是CSH，它与粘连和致病性过程有关白念珠菌．所有研究的样品都被认为是疏水的;然而,白念珠菌从HIV患者中分离出的样品比DS和ATCC的病变更疏水。CSH是一种重要的毒力特性，由包裹真菌细胞的甘露糖基化表面蛋白所赋予。其中一些蛋白质赋予真菌细胞粘附宿主细胞或无生命基质的能力，并增强对巨噬细胞的抵抗力和萌发能力，这对于慢性病变的建立至关重要[31］．

在本研究进行的口腔念珠菌病诱导试验中，所有组小鼠的舌头都接种了念珠菌悬液白念珠菌表现为念珠菌病的宏观病变特征，如存在白色区域，乳头萎缩区主要位于简单锥形乳头区域。所有组的中位数是相同的。可以观察到HIV样本组的得分较高，但组间无统计学差异。使用相同方法的研究还观察到小鼠舌背念珠菌病假膜性损伤的特征[32-37］．

镜检发现小鼠舌背有大量酵母和菌丝，大量上皮病变，接种组尤甚白念珠菌这表明它具有更高的毒性。大多数组织学切片可见轻度炎症浸润，多形核和单核存在。同时还观察到酵母下方的上皮内微脓肿和位于角蛋白层的菌丝。使用相同方法的研究还观察到小鼠舌背假膜性念珠菌病的宏观和组织学病变特征[32-39］．

这项工作的实验模型是必不可少的，以增加我们对致病性的理解白念珠菌一旦这种酵母和宿主反应的特征在临床疾病的发展中表达出来。根据这项研究，可以假设来自hiv阳性患者的临床样本毒性更强。然而，需要进一步的研究评估分子变化和免疫反应的动态感染白念珠菌寻求对人类疾病的更深入的了解和对念珠菌病病变的新疗法的开发。

的白念珠菌来自hiv阳性患者的样本被认为比ATCC菌株和从DS病变中分离的样本更具毒力在体外研究。在免疫抑制小鼠中，标准菌株ATCC 18804引起的感染和假牙口炎病变的临床样本引起的实验性口腔念珠菌感染低于临床分离菌株ATCC 18804引起的感染白念珠菌艾滋病毒阳性患者。因此，可以假设hiv阳性患者的临床样本毒性更强。

确认

这项工作得到了Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP(奖学金2013/22897- 2,2013 /07411- 6,2014 / 0791 -6)的支持。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理批准

所有适用的护理和使用动物的机构准则都得到了遵守。

在涉及动物的研究中进行的所有程序都符合该机构(UNESP科学技术研究所动物研究伦理委员会)根据第11/2014号议定书- CEUA/ICT-CJSC-UNESP制定的伦理标准。

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