比较不同的白色念珠菌的毒力隔绝艾滋病毒阳性患者的样本和义齿性口炎病变:体外和体内试验

费尔南达Freire^*费利佩•德Camargo里贝罗达马拉人da Silva阿维拉,克莉斯婷Aparecida佩雷拉,朱莉安娜坎波斯,琼奇拉安东尼奥Olavo卡多佐豪尔赫

生物科学和口服诊断、科学和技术研究所UNESP-University, Estadual保利斯塔人,圣荷西dos坎波斯,巴西

*通讯作者:: 费尔南达Freire
生物科学和口服诊断;科学与技术学院
UNESP-Univ Estadual保利斯塔人,圣荷西dos坎波斯,巴西
电话:+ 55 12 39479033
传真:+ 55 12 39479010
电子邮件:fefreire21@hotmail.com

收到日期:12/12/2016;接受日期:30/01/2017;发表日期:07/02/2017

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文摘

本研究的目的是评估念珠菌病的体外和体内毒性由白色念珠菌引起。四个临床样本,两个从艾滋病毒阳性患者(14/60)和两个义齿性口炎(DS)病变(32/62),和一个参考应变被用于这项研究。最初评估体外溶血素的分泌,脂肪酶、磷脂酶和蛋白酶酶;和细胞表面疏水性。后,小鼠免疫抑制和接种白念珠菌悬浮液。六天之后,动物安乐死和宏观的舌头被移除和组织学分析。所有样品产生毒性因素;然而,艾滋病毒阳性患者的样本更强。在宏观分析,所有组显示念珠菌病病变,它们之间没有显著差异。白念珠菌的接种组隔离艾滋病毒阳性患者有更高的酵母菌和菌丝(p = 0.0036),以及更多的组织损伤(p = 0.0016)。炎性浸润显示统计差异菌株14和62年,以及62年样本至32 (p < 0.0001)。基于这些结果可以得出结论,HIVpositive患者的临床样本更强。 The experimental model of this work was essential to increase our understanding of the pathogenicity of C. albicans.

关键字

白色念珠菌感染、口腔念珠菌病、免疫抑制实验,小鼠模型

介绍

真菌感染在口腔主要引起的白色念珠菌物种(1,2),构成的70%左右假丝酵母种虫害嘴里孤立(2]。殖民和感染白念珠菌酵母是由生物膜的形成,这是由blastoconidia不均匀混合物,假菌丝,菌丝嵌入在胞外聚合物物质形式渠道和毛孔,比浮游念珠菌表现出不同的表型特征。生物膜能保持细胞的完整性,保护从吞噬作用和限制抗真菌的扩散3]。此外,其他毒性特征白念珠菌,如粘膜细胞粘附能力转换从一个单细胞酵母丝状形式和水解的分泌细胞外酶过程中,利用宿主组织入侵和解放营养物质,使白念珠菌导致广泛的感染的病原体不同的主机网站(4]。

白念珠菌生物膜通常与义齿性口炎的发生(5,6]。义齿性口炎是一种常见的炎症性反应,多因子的病因,通常与念珠菌属的物种,特别是白念珠菌,由于其高毒性,能够坚持和形式在口腔生物膜组织和义齿表面(7]。

艾滋病病人,口腔表现是最重要和最早的指标。有七个红衣主教艾滋病毒感染的迹象:口腔念珠菌病,毛黏膜白斑病,卡波西氏肉瘤,线性牙龈红斑,坏死性溃疡性龈炎,坏死性溃疡性牙周炎和非霍奇金淋巴瘤。上面提到的特性存在于50%的艾滋病毒感染患者和80%的艾滋病患者(8]。念珠菌病是由于引起的白念珠菌(9]。有四种形式的念珠菌感染包括pseudomembranous念珠菌病、红斑的念珠菌病,增生性念珠菌病和角唇炎。已经注意到一个或多个上述的组合可能出现在病人8]。低CD4细胞计数存在于上述四种形式的念珠菌病(9]。

老鼠一直有用的动物模型实验念珠菌病的发展,因为它没有假丝酵母种虫害的组成微生物群和二次免疫反应对这种微生物。此外,这种动物很容易获得大量,介绍了免疫系统更类似于人类和他们的维护更便宜10,11]。

分析临床分离株的重要性是因为他们在毒力因素可能有所不同。因此,详细描述白念珠菌毒性的因素不仅是必要详细了解感染的过程也产生新的和更有效的抗真菌化合物(12]。

因此,本研究的目的是评估不同毒力的生产因素在体外,比较临床分离株念珠菌病引起的白念珠菌在实验小鼠模型。

材料和方法

伦理委员会

动物研究伦理委员会科学技术研究所的UNESP,批准这项研究协议号码11/2014 - CEUA / ICT-CJSC-UNESP之下。

微生物

四个临床样本白念珠菌被使用,两个从艾滋病患者(14和60)和两个与其他患者义齿性口炎病变(32和62年)。一个引用应变白念珠菌(写明ATCC 18804)(美式文化Collection-ATCC)也包括在这项研究中。临床样本之前孤立和确认13,14),参考压力,一起维护我们实验室股票集合在-80°C。

在体外毒性测试

酶和溶血的评估活动,每个样本被播种在Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA;Difco, Le Pont de Claix,法国在37ºC)和孵化24 h。接下来,样本等距spot-inoculated(~ 6毫米)在特定介质为每个酶进行了研究。每个样品测试8倍,盘子在37°C 2 - 7日天孵化。

蛋白酶分泌评估使用的两个文化传媒(15]。中,由高压灭菌、消毒由C₆H₁₂O₆,KH₂阿宝₄,MgSO₄(Diadema Labsynth SP、巴西)琼脂(Le Pont de Claix Difco,法国)和蒸馏水。中B,消毒过滤,是由牛白蛋白分数V,核黄素、烟酸、盐酸硫胺素(美国WI Sigma-Aldrich、密尔沃基)和蒸馏水。

磷脂酶生产(16念珠菌分离株)的评估使用SDA含有氯化钠、CaCl₂(Diadema Labsynth SP、巴西)和无菌蛋黄乳液添加亚碲酸钾(Himedia,孟买,印度)。

脂肪酶活性(17)是由越来越多的样品中含有蛋白胨(HiMedia) CaCl₂氯化钠(Labsynth),琼脂(Difco),二层80(美国WI Sigma-Aldrich、密尔沃基)和蒸馏水。

溶血活性(18)是评估使用SDA与C (Difco)补充₆H₁₂O₆(Labsynth)和新鲜羊血(Cecon、圣保罗、SP、巴西)。

酶和溶血活动潜伏期后确定。殖民地的菌落直径和总直径和降水区域(Pz)测定,酶活性是取得使用价格描述的方法等。16]。Pz值代表的比例仅殖民地菌落的直径+沉淀区。结果分类如下:不活动(Pz = 1),适度活动(0.64≥Pz < 1)和强大的活动(Pz < 0.64)。

CSH(细胞表面疏水性)(19每个样本的确定通过添加1毫升的二甲苯(美国WI Sigma-Aldrich、密尔沃基)每一个暂停假丝酵母spp。悬挂没有二甲苯是利用控制。孵化后在37°C水浴40分钟,较低的水相是精心收集并直接测量光谱光度测量的读数为520 nm。CSH被表示为一个百分比的酵母坚持二甲苯,由公式(CH) / (C0) C0)×100, C0的结果控制管和CH试管的结果。每个测试样本一式三份。高度疏水样本的值大于50%,而那些适度疏水值在20 - 50%之间,展出和亲水性样本那些值低于20%。

感应的口腔念珠菌病

真菌培养液的准备:口腔念珠菌病感应之前,我们做了收集口腔拭子的老鼠,播下Sabouraud葡萄糖琼脂和孵化在37°C 48 h来验证没有假丝酵母。五个样本被播种到SDA在37°C (Difco)和孵化24 h。接下来,每个样本在酵母生长氮基液体介质(Himedia,孟买,印度)与100年μM葡萄糖的添加(Vetec,里约热内卢,巴西),然后在37°C孵化18 h。离心收集的细胞和洗了三次磷酸缓冲盐(PBS)。10毫升的颗粒是resuspended PBS和调整到108可行的细胞/毫升数后纽鲍尔室(Laboroptik GMBH,糟糕的小礼帽,德国)。

实验动物:五十成年雄性老鼠(亩骶、阿尔昆、瑞士),重达30到60 g和没有假丝酵母在颊蛀牙,是包括在这项研究。食品和水源都随意,动物被保存在通风5架的能力的动物。十个动物被用于研究实验引起念珠菌病白念珠菌标准样品,四十动物实验研究的临床分离株念珠菌病引起的,将在组:14岁,60岁,32和62对每组(n = 10)。

描述的方法Takakura et al。10)被用来诱导实验念珠菌病做了一些调整。简单地说,这些动物免疫抑制与2皮下注射强的松(Depo-Medrol laboratorio辉瑞Ltda。瓜鲁柳斯、SP、巴西)的剂量100毫克/公斤体重1天前和后3天假丝酵母感染。氯四环素(Terramicina laboratorio辉瑞Ltda。,Guarulhos, SP, Brazil) was administered in the drinking water at a concentration of 0.83 mg/ml beginning 1 day before infection and maintained throughout the experiment. Intramuscular injection of chlorpromazine chloride (10 mg/kg of body weight; Amplictil, Sanofi Aventis, Suzano, SP, Brazil) was used to sedate the animals.

无菌拭子(Absorve Cral,圣保罗,SP,巴西)浸泡白念珠菌悬架是用于接种小鼠镇静通过摩擦拭子1分钟在舌背为了引起口腔念珠菌病。

的安乐死后7天内的老鼠进行了第一次免疫抑制。这个过程是由过量的麻醉剂。舌头被删除进行宏观和微观分析。

宏观分析念珠菌病的小鼠舌背:念珠菌病的病变特点使用立体显微镜观察舌背(蔡司,哥廷根,德国)。为了量化病变的数量在每个舌背,分数分配从0到4:0,正常;1,白斑在不到20%的表面;2,白斑表面覆盖在21%和90%之间;3,白斑在超过91%的表面;和4,厚厚的白色片状假膜覆盖超过91%的表面(10]。

光学显微镜的小鼠舌背:为目的的病变的显微分析,舌头都在10%福尔马林固定24小时。在石蜡包埋后,5μm组织片被削减和沾hematoxylin-eosin(他)和周期性acid-Schiff (PAS)。念珠菌病的存在进行了分析使用光学显微镜(CX41奥林巴斯,东京,日本)在X400放大。

念珠菌病病变的数量被计数量化菌丝和上皮病变组织学部分染色不是和他,分别。对于每一个污点,每个动物两组织学部分是随机挑选的。在每个组织切片,25组织学分析了字段在一个前后的方向,导致共50组织学分析。

酵母和菌丝是量化的方法等。[琼奇拉20.),将分数组织学字段如下:1,1到5酵母/菌丝;2,6 - 15酵母/菌丝;3、16 - 50酵母/菌丝;4、50多个酵母/菌丝。统计分析,从50组织学领域获得的分数中值确定每个动物。组织病变的强度被计数的组织学评估字段的存在上皮病变,如剥落、丝状乳头,分层,上皮增生,胞外分泌,海绵状结构,皮肤棘层松解,角化过度、无序的基底层,上皮内微脓肿发展。的均值与上皮病变组织学部分的数量是确定每个动物进行统计分析。

同时分析、宏观和微观、被蒙蔽研究员执行。

统计分析

获得的数据进行了分析统计借助GraphPad棱镜5软件(La Jolla GraphPad软件公司,CA,美国)。克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩的多重比较(p≤0.05)测试结果。

结果

在体外毒性测试

所有样品产生毒性因素评估在体外(表1)。pz值最低的样品,表示更大的酶活性是白念珠菌60白念珠菌14日,远离艾滋病毒阳性患者。

毒力因子	白念珠菌
毒力因子	白念珠菌(写明ATCC)	白念珠菌60	白念珠菌14	白念珠菌32	白念珠菌62年
溶血素¹	0.47±0.04^AB	0.46±0.05^AB	0.41±0.03^AB	0.52±0.08^B	0.50±0.07^AB
脂肪酶¹	0.27±0.04^AB	0.24±0.04^B	0.27±0.05^AB	0.31±0.07^AB	0.32±0.08^B
磷脂酶¹	0.71±0.08^一个	0.67±0.02^AB	0.61±0.05^B	0.68±0.02^一个	0.70±0.03^一个
蛋白酶¹	0.45±0.06^一个	0.33±0.03^B	0.34±0.03^B	0.44±0.04^交流	0.39±0.06^C
CSH²	29.79±4.08^一个	47.13±6.13^B	48.84±3.40^B	39.15±3.23^C	40.37±3.70^C

¹酶和溶血分类:- (Pz = 1),适度活动(0.6≥Pz < 1)和强大的活动(Pz < 0.64)。
²细胞表面疏水性(CSH)分类:菌株亲水(< 20%),中度CSH(20 - 50%)和高CSH (≥50%)。之间的显著差异的毒性因子表达式,每个白念珠菌菌株不同大写字母表示(假定值< 5%,克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩的多重比较检验)。

表1:白色念珠菌的毒力因素的分布。

白念珠菌60的酶活性增加脂肪酶和蛋白酶酶的分泌。然而观察统计上的显著差异在蛋白酶的分泌相比,写明ATCC 18804株(p = 0.0001),白念珠菌32个样本(p = 0.0001)白念珠菌样品62 (p = 0.0382)。

白念珠菌14获得更高的溶血素与磷脂酶的酶活性。统计学差异被发现在酶的分泌磷脂酶相比,写明ATCC 18804株(p = 0.0019);白念珠菌32 (p = 0.0497)和样例白念珠菌样品62 (p = 0.0105)。

对于CSH,白念珠菌14被认为是更多的疏水性,在一起白念珠菌60。之间的显著差异观察白念珠菌14,写明ATCC应变(p = 0.0001),白念珠菌32 (p = 0.0005);和白念珠菌62 (p = 0.0028)。为白念珠菌60岁的显著差异也观察到当写明ATCC应变相比(p = 0.0001);白念珠菌32个样本(p = 0.0052)白念珠菌样品62 (p = 0.0234)。

样品32和62,隔绝义齿性口炎病变也表现出较高的酶活性磷脂酶和蛋白酶酶和CSH写明ATCC应变比。然而观察统计上的显著差异在蛋白酶的分泌白念珠菌样品62相比,写明ATCC应变(p = 0, 0284)。CSH之间也具有统计学意义白念珠菌样例32和写明ATCC应变(p = 0.0008),和之间白念珠菌样品62和写明ATCC应变(p = 0.0002)。

宏观分析白色念珠菌感染舌背

宏观的分析表明,所有组接种悬浮液白念珠菌在舌背,念珠菌病病变(图1)。中间值的分数分配宏观分析在所有组都是一样的。它可以观察到更高的分数为临床分离株白念珠菌艾滋病毒阳性患者,但组之间没有统计学差异(p = 0.7313) (图2)。

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图1:宏观分析念珠菌病的病变。图像显示的病变写明ATCC 18804株临床分离株(a)和14 (b), 60 (c), 62 (d) e C32 (e),显示白色区域的存在(▲)和乳头萎缩(↓)。

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图2:从宏观检验获得分数和中位数的舌背组感染写明ATCC 18804株临床分离株。(克鲁斯卡尔-沃利斯= 0.7313)。GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)被用来创建这个艺术品。

微观的分析白色念珠菌感染舌背

微观分析是由量化的酵母和菌丝,上皮变化和结缔组织的炎症浸润的程度。

念珠菌病病变、酵母和菌丝观察舌背的角蛋白层有限,主要集中在简单的锥形乳头状突起,有时在舌头的背。当有更高浓度的念珠菌属,发现存在多形核白细胞的上皮形成上皮内microabcesses和结缔组织炎性浸润的存在。

酵母和菌丝在50量化为每个动物组织学字段。接种临床分离株白念珠菌从艾滋病毒阳性患者(14和60)有更高的酵母和菌丝(图3组),统计差异分析(p = 0.0036),显示这些分离株致病性更高(图4)。

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图3:矢状切口感染的小鼠舌背的写明ATCC 18804株临床分离株。酵母菌和菌丝在上皮细胞角蛋白(↓)和(▼)写明ATCC 18804年临床分离菌株(a)和14 (b), 60 (c), 62 (d) e C32 (e)不是;放大:200 x。

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图4:分数和中位数的菌丝和酵母数量来自50个组织学分析领域的写明ATCC 18804株临床分离株。(Kruskal -沃利斯= 0.0036)。值紧随其后不同大写字母表示团体之间的显著差异。GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)被用来创建这个艺术品

上皮改变量化,揭示众多剥落等上皮的损伤,丝状乳头,分层,上皮增生,胞外分泌,海绵状结构,皮肤棘层松解,角化过度、无序的基底层,上皮内微脓肿发展。临床样本白念珠菌从艾滋病毒阳性患者(14、60)比其他组织损伤组(图5),有统计差异(p = 0.0016) (图6)。已经在临床样本义齿性口炎病变(32和62)一些上皮的变化观察其他组(图5)。

图5:矢状切口感染的小鼠舌背的写明ATCC 18804株临床分离株,显示轻度和中度炎性浸润在写明ATCC 18804株临床分离株(a)和(b) 14日,60 (c), 62 (d) e C32 (e),它可以观察到的所有病变研究:剥落(f),丝状乳头(g)的损失,损失的分层(h)、上皮增生(我),胞外分泌(j),海绵状结构(k),皮肤棘层松解(l),角化过度(m),混乱的基底层(n)和上皮内微脓肿发展(o)。他;放大:400 x。

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图6:上皮细胞数量变化和中位数在念珠菌病舌背的微观损伤小鼠感染写明ATCC 18804株临床分离株。(Kruskal -沃利斯= 0.0016)。值紧随其后不同大写字母表示团体之间的显著差异。GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)被用来创建这个艺术品

结果炎性浸润的作业分数,显示统计差异组14和62年以及62年样本至32 p < 0.0001的价值(图7)。

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图7:分数和中位数的炎性浸润的程度结缔组织中观察到的微观念珠菌病病变的背老鼠´s舌头写明ATCC 18804株临床分离株感染(Kruskal -沃利斯< 0.0001)。值紧随其后不同大写字母表示团体之间的显著差异。GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)被用来创建这个艺术品。

讨论

假丝酵母种虫害共生的发现在人类口腔的30 - 50%。然而,在某些情况下,共生的真菌可以成为机会致病菌,导致表面和/或系统性真菌病。作为最常见的机会性感染,口腔念珠菌病的发病率迅速增加几十年来由于越来越多的破坏宿主如器官移植患者,感染艾滋病毒,经历化疗或由于滥用抗生素21,22]。

佩雷拉et al。14孤立的,量化的,确定的,而投机取巧微生物从prosthesis-fitting表面,硬腭,口腔冲洗个人穿着可拆卸上颌假肢(50)和没有(50)义齿性口炎的病变。白念珠菌经常是最孤立的酵母种类两组,之后c . tropicalis和c . glabrata。在类似的研究中,马丁斯et al。23),孤立和确定口腔的发病率假丝酵母种虫害在牙科假肢。从牙科口腔拭子采集接口的66名患者白色念珠菌经常是最孤立的微生物(63%)。出于这个原因,本研究使用了两个白念珠菌义齿性口炎损伤来验证其毒性临床分离菌在口腔念珠菌病的形成。

等琼奇拉。13)收集了60的念珠菌病样本血清反应阳性的艾滋病患者,由API20C标识系统,发现最常见的孤立的物种白念珠菌(51.56%)non-albicans紧随其后假丝酵母spp。(43.73%)。同时,表明这些物种对氟康唑耐药和两性霉素B,重要的抗真菌治疗念珠菌病。在一个类似的研究由Maheshwari et al。24),共有128个假丝酵母分离得到从88年艾滋病毒血清反应阳性的病例和7个不同的念珠菌属物种被确定。白念珠菌是最常见的物种隔离(50%)。Gemaque et al。25)调查了107名患者的传染性传染病流行的帕拉州联邦大学的大学医院和验证,肺结核是最普遍的疾病(40岁的2%),其次是艾滋病(32岁,7%)。和这些患者中最常见的损伤是牙周病(57岁的5%)和口腔念珠菌病(22日8%)。贝尔贝里和Noujeim26在一个描述性的横断面研究在两年时间内,50个患者艾滋病毒感染进行了评估。所有的病人显示至少一个口头表现。最常见的口腔病变识别伪膜性念珠菌病占76%(38/50),其次是牙周疾病占34%(17/50),疱疹的损伤和多毛的黏膜白斑病10%(5/50),齿龈炎8%(4/50),口腔溃疡8%(4/50),卡波西氏肉瘤6%(3/50)和2%(1/50)非霍奇金淋巴瘤。因此,也被用于临床白念珠菌HIV阳性的病人的样本来验证他们的毒性在体外口腔念珠菌病的形成,除了相比,其毒性与义齿性口炎的样本的毒性损伤和标准写明ATCC 18804株。

转换从一个无害的共生体的毒性病原体来自一个广泛的选择性表达毒性因素(27]。在目前的研究中,我们评估在体外五种不同属性的毒性:溶血素的分泌、脂肪酶、磷脂酶和蛋白酶酶;和CSH。所有样品研究产生毒性因素,然而,样本与艾滋病患者被认为比写明ATCC最致命和DS的病变样本。这些示例展示了强大的酶活性,被认为是最疏水。

坚持宿主组织,这是殖民和随后的感染,所需引用的感染过程的第一阶段的念珠菌属(28]。胞外水解酶的研究目前的研究被认为念珠菌过度生长中发挥重要作用,因为这些促进依从性,组织渗透和随后的入侵宿主。蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶降低一些生理上重要的基质,如白蛋白、免疫球蛋白,磷脂和皮肤的蛋白质,从而导致上皮细胞膜的破裂,使菌丝进入细胞质的渗透过程中感染(29日,30.]。除了水解胞外酶也评估了样品的溶血能力白念珠菌在blood-enriched媒介。在这些文化条件下,白念珠菌样品展示了强大的溶血活性。白念珠菌破坏红细胞获得铁生产物质称为溶血素。此外,溶血素的分泌,其次是铁收购有利于菌丝的入侵和播散性念珠菌病的发展(4]。

另一个毒力因素的评价本研究CSH,与粘附和致病过程白念珠菌。所有样本研究被认为是疏水性;然而,白念珠菌样品与艾滋病患者更疏水比DS和写明ATCC的病变。CSH是一个重要的毒性产权授予的mannosylated外套真菌细胞表面蛋白。这些蛋白质授予真菌细胞的能力遵守宿主细胞或无生命的根基和增加抗巨噬细胞和萌发能力,都是至关重要的,建立慢性病变(31日]。

执行的口腔念珠菌病的分析归纳在这项研究中,老鼠的舌头悬浮液接种组白念珠菌表现出宏观念珠菌病的病变特点,与乳头状白色区域的存在萎缩区域主要分布在该地区的简单的锥形乳头状突起。所有组中值是一样的。它可以观察到更高的分数对于艾滋病毒样本组,但没有统计学差异组。使用相同的方法研究还观察到的特性念珠菌病pseudomembranous损伤小鼠舌背的(32- - - - - -37]。

微观分析中发现许多酵母和菌丝的背老鼠舌头和许多上皮病变,特别是在组织接种白念珠菌HIV阳性的患者,表明其较高的毒性。观察轻度炎性浸润在大多数组织部分多形核的存在和单核。也观察上皮内微小脓肿的酵母和菌丝位于角蛋白层。使用相同的方法研究还观察到宏观和组织学损伤特性的念珠菌病pseudomembranous小鼠舌背的(32- - - - - -39]。

这项工作至关重要的实验模型来增加我们的理解的致病性白念珠菌的特点,一旦这种酵母表达和宿主反应在临床疾病的发展。在此基础上研究它可以假定艾滋病毒阳性患者的临床样本更强。然而,还需要进一步的研究来评估分子改变和感染的免疫反应的动力学白念珠菌寻找一个更大的理解人类疾病和念珠菌病病变的新疗法的发展。

的白念珠菌艾滋病毒阳性患者的样本被认为是毒性比写明ATCC应变和DS的病变样本在体外研究。实验在免疫抑制小鼠口腔念珠菌病是写明ATCC 18804低标准菌株引起的感染和临床样本义齿性口炎病变的临床分离株引起的感染白念珠菌艾滋病毒阳性患者。因此,可以认为,艾滋病毒阳性患者的临床样本更强。

确认

这项工作是企业管理学院德基金会支持的“尽管做Estado de圣保罗——FAPESP(奖学金2013/22897 - 2,2013/07411-6和2014/07791-6)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

伦理批准

所有适用的制度动物保健和使用指南。

所有程序中执行研究涉及动物按照道德标准的机构(动物研究伦理委员会科学技术研究所的UNESP)协议号码11/2014 - CEUA / ICT-CJSC-UNESP下。

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