研究与评论:牙科科学杂雷竞技苹果下载志
菜单e-ISSN: 2320-7949和p-ISSN: 2322-0090
e-ISSN: 2320-7949和p-ISSN: 2322-0090
收到日期:17/12/2015接受日期:19/02/2016发表日期:26/02/2016
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成牙髓细胞(OCL)和亚成牙髓细胞层(SOCL)之间的结构和功能相互关系与健康和疾病中的组织形成和调节有关，但尚不完全清楚。本研究采用当代免疫组化技术，对啮齿动物下颌切牙根尖部分的组织复杂性获得重要的新见解。从刚杀死的wistar大鼠中取出整颗切牙，在4%多聚甲醛中固定，脱矿，并准备进行标准免疫组化。在荧光显微镜检查前，用波形蛋白、α肌动蛋白、NaKATPase、α微管蛋白和COX 1的一抗和alexafluor 488和594的二抗标记组织。成牙细胞呈分层或伪分层排列，而不是简单的柱状排列。另外的星形细胞，α-肌动蛋白免疫反应，主要观察到在OCL的远端一半。富细胞区(crz)的细胞也表现出复杂性，细胞密度高，细胞核大，细胞质稀疏。这些细胞表现出强烈的nakatp酶免疫反应。这些细胞中的一些将进程发送到OCL，而其他进程则保留在crz内。没有向下的进程。 The OCL of the rat mandibular incisor presents a hitherto undescribed complexity, in terms of cellular arrangement and composition, the functional significance of which is not immediately apparent. The observation that cellular processes from crz tothe OCL and lateral processes within crz suggest functional connectivityand cell to cell communication within the layer. The intense immunoreactivity to NaKATPase suggests functional specification and a high degree of tissue activity. Structural observations will require further investigations.
成牙细胞，牙髓生物学，成纤维细胞，细胞生物学，复杂性，细胞信号
成牙本质细胞是一种特化的细胞群，主要作用于牙本质基质的分泌和矿化。其他作用还包括调节牙本质的渗透性1]，参与免疫反应Horst等。
［2]，酶产卡里姆等[3.]，信号与机械转导Magloire等[4]，通过动作电位的产生Allard等[5］．Son等。[6Byers和Westenbroek [7]， Okumura等。[8］．成牙本质细胞通常呈柱状或伪分层，一个细胞质突从每个细胞延伸到牙本质的管状结构。Luukko等人[9］．它们的位置促进了它们在调节牙髓牙本质屏障Bishop和在应对有害刺激时保持组织完整性方面的作用。10］．成牙本质细胞层(OCL)和亚成牙本质细胞层(SOCL)之间的相互作用可能在这些作用中起重要作用。
持续生长的大鼠门牙是一个完善的研究模块，有助于细胞生命周期的研究Ohshima和Yoshida [11]，从组织形成到成熟到衰老和对损伤的反应[12]，原田等。[13］．胸衣及绒布[14]，涉及治疗药物Murray等的影响的调查。[15]、生物活性分子斯隆和史密斯[16D’souza等人。[17］．外科手术程序和材料Murray等。[18已经被描述过了。
本研究应用当代免疫组化技术，对大鼠切牙OCL和SOCL的结构和功能复杂性有了新的认识，这可能是进一步理解的基础治疗应用史密斯等。[19］．
髓组织的收获和制备
整个啮齿动物牙髓的分离与固定
取刚宰杀的Wistar大鼠(体重300-600 gm)下颌骨切牙(n=20)，高速刺槽、水冷却后纵向切开。用镊子将牙髓组织转移到4%多聚甲醛新鲜溶液中，4°C浸泡3-4小时，然后用PBS冲洗2次低温贮藏在分级蔗糖溶液中(10%，20%和30%，在4°C下各24小时)。
软化牙:取10颗切牙，在持续水冷却下，用金刚石盘将切牙水平切成尖、切区。Boushell等人在4˚C的4%多聚甲醛中固定24小时。[20.]，然后在17% EDTA (pH 7.4, 4°C, 4-6周)中脱矿[21］．每周更换两次溶液，在PBS中洗涤10分钟冷冻保存。然后将样品浸泡在最佳切割温度的介质中(OCT, Tissue Tek，荷兰)，在异戊烷和液氮中快速冷冻，并在-80°C保存。用冷冻机(shan cryotome FSE, Thermo Fisher Scientific, USA)从冷冻块中制备厚度为8 μm的切片，并安装在载玻片上，然后进行台架干燥。将载玻片存放在Coplin Jar中，并使用3D摇摆平台(Stewart Scientific, UK)用TBS、TBS- t和TBS清洗3次5分钟。
染色的部分
主要的抗体(表1)然后涂抹，并将载玻片储存在4°C的加湿室中过夜。
表1。本研究中使用的一抗列表。
第二天，将载玻片移回Coplin Jar，在TBS、TBS- t和TBS中洗涤三次，在第一次二抗之前清洗20分钟(表2)在黑暗潮湿的环境中放置1小时。然后在使用第二种二抗之前再次清洗载玻片(表2)在黑暗潮湿的环境中放置1小时。
表2。本研究中使用的二抗列表。
然后像以前一样清洗和干燥载玻片，用DAPI (Vector laboratories Inc.， Burlingame USA)、一滴PBS +甘油和玻璃盖片覆盖Vectashield硬固化安装介质，在荧光显微镜(Olympus BX61)下以10倍、20倍和60倍放大倍率检查之前，用指甲油在周围密封。
染色切片检查:使用显微镜安装的Olympus XM 10单色相机拍摄相关图像，并使用Image J软件(基于Java的图像处理程序-美国国立卫生研究院)进行检查。
计算:使用Olympus显微镜Cell F软件测量牙髓不同组成部分的长度和厚度。
图1显示从去矿化标本的顶端一半的低倍图像，唇侧显示在图1一个舌侧向内图1 b．切片用结构蛋白vimentin (vim:绿色)和NaKATPase (nak:红色)抗体染色;DAPI为核染剂(DAPI:蓝色)。两幅图像都提供了硬组织和软组织的概述，包括牙本质(de)、成牙本质细胞层(od)和牙本质内的成牙本质细胞过程(odp)。在成牙髓细胞层(OCL)的正下方是细胞丰富区(crz)，其厚度和细胞密度各不相同。在图像A和B中，在成牙本质细胞的远端区域及其突起(odp)中观察到vim-IR，细胞核位于细胞的近端区域。这些图像显示成牙本质细胞呈分层或伪分层排列，细胞体呈球状而非高柱状，细胞核呈两条或多条线排列。crz和牙髓间质细胞对波形蛋白(vim-IR)具有免疫反应性。NaKATPase IR在纸浆的OCL和体积中强度较低。这些切片还显示了牙髓唇侧和舌侧的差异，平均OCL厚度有明显差异(唇侧(72 μm)比舌侧(66 μm)厚)。 The crz also thicker labially (53 μm) than lingually (37.5 μm).
图1所示。去矿化的大鼠切牙根根尖部的细胞成分和牙本质概述:A(唇侧)和B(舌侧)显示vimentin抗体(vim:绿色)、NaKATPase抗体(nak:红色)和核染色(dapi:蓝色)。在A和B中，牙本质(de)都被清晰地识别出来，包含几个成牙本质突(odp)，而正下方是牙髓，其中包含一层成牙本质细胞(od)，一个细胞丰富区(crz)和大部分牙髓(pulp)。右侧面板显示了Vim-IR, NaKATPase-IR和dapi的单独图像。所有图像均显示100 μm刻度条。
图2这是脱矿的大鼠下颌骨门牙顶端的高倍图像。切片用波形蛋白抗体(vim:绿色)、α-平滑肌肌动蛋白抗体(actin:红色)染色，核用dapi染色(dapi:蓝色)。A和B都聚焦于OCL内分散的肌动蛋白- ir细胞的od(箭头)。与周围的od相比，这些细胞的vim-IR减少，并且似乎仅在上颌上颌膜的远端(靠近牙本质)发现，其外观提示肌动蛋白- ir细胞之间的连通性。
图2。下颌骨切牙中段脱矿切片，显示成牙细胞层及相关血管:A、B切片用波形蛋白抗体(vim:绿色)、α-平滑肌肌动蛋白抗体(actin:红色)和核染色(dapi:蓝色)染色。切面为高倍放大图像，显示成牙本质细胞层，在成牙本质细胞层远端靠近牙髓/牙龈交界处的成牙本质细胞层内存在其他细胞(箭头所指)。这些细胞显示α-肌动蛋白- ird，但如个别染色右侧图像所示，对vim呈阴性。C段vimentin抗体(vim:绿色)和dapi抗体(dapi:蓝色)染色显示许多血管，一些从牙髓进入成牙细胞层，其他分裂，许多靠近矿化前沿。D为vimentin (vim:绿色)、NaKATPase (nak:红色)和dapi(蓝色)抗体染色的切片，显示平行于成牙细胞层的血管和平行于牙本质的血管。E切片用NaKATPase-IR检测的脱矿组织显示血管分裂。F切片为脱矿组织，vim-IR显示血管穿过整个成牙细胞层。所有图像的校准条均为50 μm。
C、D、E和F用vimentin抗体(vim:绿色)和NaKATPase抗体(nak:红色)染色，核染色dapi (dapi:蓝色)，再次显示成牙细胞的球状形状和细胞核的波浪线。OCL和SOCL内血管复杂，有许多不同形态的小血管，包括相对宽大的血管血血管crz缩小,因为他们之前输入OCL和穿越其厚度分叉成矿前面板(C),管靠近成矿前(电池板C和D),一个血管平行之前OCL分叉形成Y形血管(面板E)和一个血管平行od和穿越的OCL成矿前面板(F) .Most血管内的OCL靠近成矿前。
图3用vimentin抗体(vim:绿色)、NaKATPase抗体(nak:红色)和核染色dapi抗体(dapi:蓝色)染色，高倍显示一个细胞，其细胞体位于crz(箭头)，细胞向OCL延伸，在od之间，延伸到OCL厚度的一半左右。成牙本质细胞呈球状。B为染色后未脱矿的髓组织切片抗体到波形蛋白(vim:绿色)和核染色dapi (dapi:蓝色)，并进一步证明存在从crz内的细胞向OCL延伸的细胞过程，其中一些渗透到OCL并在od之间运行(箭头)，而另一些则发送短的水平过程，保持在该区域内(星号*箭头)。没有证据表明从crz细胞向下延伸到髓体的细胞过程。
图3。大鼠下颌骨切牙切片显示成牙本质细胞层和成牙本质细胞层:A为去矿化切片的高倍放大图像，经波形蛋白(vim:绿色)、NaKATPase (nak:红色)和dapi (dapi:蓝色)抗体染色。彩色图像中的箭头指的是细胞体及其从富细胞区(crz)到成牙本质细胞层(od)的过程。右边的面板是vimentin和NaKATPase的单独图像。B示vimentin (vim:绿色)和dapi (dapi:蓝色)抗体染色切片。可以识别成牙髓细胞层(od)、细胞富区(crz)和髓体(pulp)。这些图像显示，富细胞区的一些成牙本质细胞向成牙本质细胞层(箭头)发送长细胞突，其中一些细胞突渗入成牙本质细胞层并在成牙本质细胞之间运行。一些bodontoblast细胞也发送短的水平过程，保持在细胞丰富区(星号箭头)。未见细胞突起从富细胞区向髓体延伸。A为50 μm, B为100 μm。
图4一低倍率图像显示去矿化后的标本，分别用波形蛋白抗体(vim:绿色)、α-平滑肌肌动蛋白抗体(actin:红色)染色，用dapi核染色(蓝色)。可见唇侧(每张图像的顶部)和舌侧(每张图像的底部)，舌侧的免疫反应性较高。
图4。大鼠下颌骨切牙切片，显示牙髓的整体厚度和细胞异质性:A为波形蛋白抗体(vim:绿色)、α平滑肌肌动蛋白抗体(actin:红色)染色切片和dapi核染色切片(dapi:蓝色)。在本切片中，成牙细胞(od)和细胞丰富区(crz)的唇区和舌区都很清楚，唇侧在上，舌侧在下。这一切片可以证明α平滑肌肌动蛋白在牙髓内的分布更多地分布在舌侧而不是唇侧。右边的黑白图像显示α-肌动蛋白红外光谱，可以清楚地分辨出这一点。B段和C段用抗波形蛋白(vim:绿色)、微管蛋白(tub:红色)和dapi作为核染色。B为牙髓区对微管蛋白有免疫反应的细胞。C表示对微管蛋白免疫反应阳性的细胞可能以特定的方式排列;有时呈叶状或管状，有时呈带腔的细胞群(箭头)。D切片用环氧合酶-1抗体(cox-1:绿色)、NOS (NOS:红色)染色，dapi为核染色(dapi:蓝色)，显示成牙釉质亚区对cox-1免疫反应阳性的细胞(箭头)，(D)为单个cox-1 IR细胞的黑白图像。所有COX-1 IR和tub-IR细胞对波形蛋白的免疫反应性非常低或没有。 Calibration bars is 100 μm in A and 50 μm in B, C and D.
B、C和D为非脱盐切片，在A中用波形蛋白(vim:绿色)、微管蛋白(tub:红色)、B和C中波形蛋白(vim:绿色)、微管蛋白(tub:红色)以及D中环氧合酶-1 (cox1:绿色)、一氧化氮合酶-1 (nos-1:红色)的抗体染色，在所有图中用dapi作为核染色(蓝色)。这些切片显示髓体内细胞的异质性。B图显示微管蛋白- ir细胞分散在波形蛋白- ir细胞之间，呈单个梭形细胞。C图显示了小管ir细胞或细胞聚集物，形成特定的形状和图案，如管状、叶状或星形。有时这些细胞聚集在管腔周围。图D显示环氧化酶-1免疫反应性细胞分散在这些细胞层。A、B、C组细胞的vimentin-IR含量均低于周围细胞。
中所示的漫画总结了观察结果(图5)。
图5。图示大鼠下颌切牙根尖部成牙本质细胞层和成牙本质细胞层的结构复杂性和细胞异质性。成牙本质细胞层是呈分层或拟分层排列的复杂层，成牙本质细胞呈球状。注意在成牙本质细胞层中存在不同类型的α-actin IR细胞。矿化前缘附近有小动脉无血管网络。富细胞区的一些细胞似乎向成牙细胞层发送长过程，这表明这两层之间可能存在功能性串音。crz中的其他细胞发送短的水平突起，没有指向髓体的突起。牙髓的体积显示出一定程度的细胞异质性。
先前的研究报道，在大鼠下颌切牙中，在活跃的牙本质沉积阶段，成牙细胞呈高大的柱状，细胞核位于细胞体的近端，高尔基体位于细胞核的正上方，与内质网几乎占据了Arana-Chavez和Massa细胞体的所有远端部分。
目前的研究呈现出不同的画面，成牙母细胞呈球状，近端较宽，远端较窄。此外，少数切片显示成牙本质细胞呈单层;相反，它表现为两个或两个以上细胞厚的分层或伪分层排列，细胞核表现为波浪线。可能的解释可能是，并非所有的成牙本质细胞体都与牙本质密切接触，这就提出了一个问题，即一些成牙本质细胞是否可能与活跃的细胞一起发挥支持作用，或者存在某种类型的连续性，雷竞技网页版即细胞轮流沉积牙本质基质，而其他细胞则处于休眠状态。OCL通常被认为是专属于成牙根细胞的，偶有抗原呈递的树突细胞Tsuruga等。[22]，对成牙细胞功能和分化起调节作用。[23］．树突细胞的存在也突出了成牙细胞所占据的潜在重要界面。在目前的研究中观察到的部分似乎证实了在OCL中存在一个额外的、迄今为止尚未描述的细胞群。这些细胞在形态上与成牙本质细胞不同，对α-平滑肌肌动蛋白免疫反应，对波形蛋白阴性(与成牙本质细胞相反)。可以想象，这些细胞可能是树突状细胞，有助于复杂的免疫防御机制，I类主要组织相容性复合体(MHC)呈递成牙母细胞作为抗原识别细胞Farges等。[24，霍斯特等人。[25]，凯勒等人。[26]和II类MHC作为抗原提呈细胞的树突细胞Yoshiba等人[27］．并可能被杜兰德等人吸引到该地区。[28]荷兰及波特罗[29］．
紧接在成牙本质细胞下方的是crz，其细胞密集，被认为能够分化为其他类型的细胞，包括当条件要求时，Couble等人。[30.]，菲茨杰拉德等人。[31， Luukko等人。[8］．以前的研究表明，如果成牙本质细胞受到不可逆的损伤或死亡，它们将被来自crz Fitzgerald等人的细胞所取代。[31］．在其有丝分裂活性增加后，Murray等人[32-34］．crz中的细胞呈现一系列形状，从多边形到星形细胞过程，这些形状促进细胞相互作用，并积极促进细胞中复杂的信号通路牙科pulp Bongenhielm等。[35］．Woodnutt等人。[36］．山口等人。[37］．目前的研究结果证实了crz细胞之间存在细胞突，但没有证据表明有任何细胞突向下指向牙髓核心。相比之下，细胞突经常从crz向成牙本质层延伸，延伸约为其伪分层结构厚度的一半。这一发现可能表明crz和成牙本质层之间存在以前未被认识到的细胞相互作用，可能存在感觉、防御、机械敏感的Magloire等人[4]或其他调节功能。
大鼠切牙crz细胞内质网和高尔基体发育不全，提示它们不太可能参与蛋白质合成和分泌。大量发育良好的线粒体38]，表明这些细胞具有较高的代谢率翟等。[39］．运输上皮细胞Silverthorn等[40］．与CRZ细胞具有相同的组织学和形态学特征。这些包括细胞投影(增加表面积)和发育良好的大量线粒体。这些特征以及对NaKATPase的强IR提示这些细胞可能参与了从牙髓到OCL的液体和离子的主动运输和再吸收。本研究的数据证实了先前关于大鼠切牙大岛和吉田根尖部的OCL和crz在唇侧和舌侧厚度的差异，OCL在唇侧比舌侧高(分别为70 ~ 80 μm和55 ~ 63 μm)， crz在唇侧比舌侧更突出和厚(分别为50 ~ 60 μm和33 ~ 40 μm)。已知髓核含有其他类型的细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和免疫细胞Luukko等人。8］．目前对髓核内具有不同免疫反应性的细胞的观察可能是相当重要的。对环氧合酶-1免疫反应的细胞可能表明其功能和信号活性。对微管蛋白免疫反应的细胞以两种不同的模式出现，一种是分散在牙髓内的单个细胞，另一种是聚集细胞的特定模式，有时与狭窄的空腔有关。细胞的这种异质性可能与牙髓复合体中各种功能和重要作用有关，但目前尚不清楚。
目前工作的另一个发现是牙髓核心细胞中α-平滑肌肌动蛋白的表达。这种表达似乎在唇上较少，并在强度上增加
舌侧。综上所述，本研究结果表明，牙髓的OCL、crz和核心是异质的，结构比以往报道的更为复杂。这种复杂性的功能含义目前尚不清楚，但它可能突出了重要的和
复杂的细胞相互作用可能涉及成牙本质细胞-成牙本质细胞，成牙本质细胞-成牙本质细胞过程和/或成牙本质细胞-次成牙本质细胞层。这些观察结果值得在动物和人类组织中进行进一步的研究。
这项研究由伊拉克高等教育部资助，是博士奖学金计划的一部分。作者感谢纽卡斯尔大学口腔科学学院口腔生物学实验室在实验工作中的作用。
作者声明，就本文的作者和/或发表而言，没有潜在的利益冲突。
