研究与评论:药物分析杂雷竞技苹果下载志
菜单e-ISSN: 2320 - 0812
e-ISSN: 2320 - 0812
剑张*
J博士咨询公司，美国佐治亚州亚特兰大花路南3133号J单元，邮编30341
收到日期:18/04/2016;接受日期:06/06/2016;发表日期:13/06/2016
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一个结合反应研究了n -乙酰酪氨酸与三磷酸腺苷(ATP)的相互作用质谱分析为了了解蛋白质中酪氨酸磷酸化的机制。在500 μL的20mm碳酸氢铵(pH 7.4)中制备了含10 mM n -乙酰酪氨酸、6.4 mM ATP二钠、250 μM FeCl2和0.15% H2O2的反应溶液。反应在室温下进行48小时，然后进行质谱分析。研究发现，该反应由Fe(II)/H2O2体系和n -乙酰酪氨酸羧基端与亚铁离子结合催化。反应产物为酪氨酸酚基和ATP磷酸基的缩合物，化学计量比为1:1或更高，对应的m/z值为736、981和1248。该研究还表明，需要额外的ATP水解步骤，从缀合物生成磷- n -乙酰酪氨酸(mw303)。该反应可能是活生物体中酪氨酸磷酸化的前驱步骤。
n -乙酰酪氨酸，三磷酸腺苷(ATP)，缀合反应，金属催化，质谱分析。
酪氨酸磷酸化是将三磷酸腺苷(ATP)的磷酸(PO4 3-)基团添加到蛋白质中的酪氨酸残基上的反应。该反应是1979年在多瘤病毒的研究中发现的，后来认为酪氨酸磷酸化是蛋白信号转导和调控的关键步骤酶活性［1-3.]。磷酸基转移的反应必须通过酪氨酸激酶的催化进行。如果没有这种酶，这种反应只能在恶劣的条件下发生有机合成［2，4，5它们并不存在于人体内。具体的机理酶催化不是很清楚。我推测该反应可能与Fe(II)、Cu(II)等过渡金属离子有关，因为这些离子会产生自由基，自由基会与生物系统中的许多物种发生反应[6-8]。
作者之前的研究表明，当酪氨酸与羧基相邻时，如Glu-Tyr和N-acetyl tyrosine，金属催化氧化速率显著增加。这是由于羧基与铁离子和铜离子结合，在酪氨酸的酚基附近产生自由基[6]。相反，酪氨酸的n端和其他带正电基团的多肽减慢了氧化反应，因为它们不利于金属离子的结合。Glu-Tyr和n -乙酰酪氨酸的氧化产物也比以单羟基化酪氨酸(或DOPA)为主的酪氨酸的氧化产物复杂[6-9]。例如，n -乙酰酪氨酸的两种氧化产物是氧化DOPA的醌类化合物。这些氧化产物中的一些可能是反应性的，并受到进一步的化学修饰。在另一项研究中，作者发现乙酰水杨酸(阿司匹林)可以与亚铁离子和内源性物质葡萄糖酸形成三组分络合物，这种络合加速了阿司匹林的水解。水解产物水杨酸和乙酸与葡萄糖酸的羟基发生缩合反应，形成水杨酸-葡萄糖酸缀合物和乙酰化葡萄糖酸[10]。已知ATP的磷酸基能与金属离子络合[11]，因此，酪氨酸、ATP和过渡金属离子很可能通过形成一个三级复合物中间体来生成磷酸酪氨酸。下面的研究试图证明这种反应路径的可能性。
反应溶液含有10mm n -乙酰酪氨酸，6.4 mM ATP二钠，250 μM FeCl2，和0.15% H2O2在500 μL的20mm碳酸氢铵(pH 7.4)中制备。这些化学品是从西格玛·奥尔德里奇那里买的。反应在室温下进行48小时。然后将样品在80%甲醇/1%甲酸中按1:5的比例稀释进行质谱分析(Orbitrap, Thermo Scientific)，仪器参数如下:选择离子监测(Ion Monitoring, SIM) FTMS数据，以3 uL/min直接输注;AGC = 5 e4;分辨率= 60 K;1微扫描;最大注射时间50毫秒;喷淋电压4.3 kV; tube lens=110 V.
n -乙酰酪氨酸的质谱如图所示图1一个。224 m/z的峰为分子离子，246 m/z和268 m/z的峰为n -乙酰酪氨酸钠加合物。反应后，224 m/z峰强度下降约44%。ATP的质谱示于图1 b。ATP的分子离子峰(507 m/z)不太明显，而530 m/z和552 m/z的峰对应于ATP的单钠盐和双钠盐。反应后这两个峰的强度分别降低了约66%和50%。491 m/z和513 m/z峰可能是脱氧- atp的离子加合物和钠加合物，也可能是二乙酰酪氨酸的钠加合物;它们不存在于纯ATP的光谱中[12]。反应产物的质谱如图所示图1 c。736 m/z和758 m/z的峰值可归因于n -乙酰酪氨酸和ATP的冷凝形成，如图所示方案1。这个分子的分子量是712da，可以和一个或两个钠离子结合，变成735da和758da。在1000 w/z以上还有其他峰，这与n -乙酰酪氨酸和ATP的其他共轭产物的结构有关(例如，在2:1和3:1的化学计量)，因为该反应是连续的，不太有选择性。有趣的是，在本实验中只检测到非常少量的磷-乙酰酪氨酸(303 m/z和304 m/z)，相当于n -乙酰酪氨酸的1/44(谱见图1 d）.这表明ATP的磷酸基没有水解，这需要酶的裂解生物系统。
图1所示。质谱反应溶液中含有10mm n -乙酰酪氨酸，6.4 mM ATP二钠，250 μM FeCl2，和0.15% H2O2(稀释5倍进行分析)。
方案1。n -乙酰酪氨酸与ATP的反应
本研究结果推断，生物系统中的酪氨酸磷酸化可能是一种类似于ATP合成的氧化反应[13，14]，并且酪氨酸残基可能直接结合或非常靠近酪氨酸激酶中的Fe(II)部分以催化反应。它还可以从含有Fe-S团簇形式的过渡金属离子和多种金属辅因子的电子传递链中获得电子[15-18]。该酶还有一个额外的功能，即在氧化磷酸化反应后水解ATP中的磷酸基。
n -乙酰酪氨酸和三磷酸腺苷(ATP)在Fe(II)/ H存在下可以偶联在一起2O2通过缩合反应。该反应可能是活生物体中酪氨酸磷酸化的前驱步骤。它还可能对n -乙酰酪氨酸的药理学和毒理学有其他影响，n -乙酰酪氨酸是一种常用的大脑补充剂。
作者非常感谢B. Mooney先生进行的实验和分析。
