关键字 |
| 黄曲霉,真菌性鼻窦炎,鼻灌洗,鼻息肉,PCR |
介绍 |
| 真菌在环境中无处不在,可以共存健康sino-nasal呼吸道内的主机作为腐生或共生体。10%的人他们会引发慢性鼻窦炎的发展(CRS)尽管的确切原因尚不清楚。据估计,在任何时候20%的世界人口受到CRS [1]。型鼻-鼻窦真菌病的确切负担在慢性鼻窦炎患者在印度并不广为人知,但这些感染的发病率正在增加,没有人口基础数据是可用的。的真菌过敏的原因存在于粘蛋白,并提供持续的刺激。在西方dematiaceous组曲霉属真菌物种特别A.flavus是最常见的病因代理在印度和中东[2]。 |
| 正确的和及时的诊断型鼻-鼻窦真菌病是必须的治疗和预后显著不同。传统的诊断方法在不同的实验室,可能不准确,需要一定的时间,常常可能无法识别稀疏真菌过敏黏液或组织中的元素。 |
| 聚合酶链反应(PCR)因此被应用,以满足这些需求所记录的许多研究人员(3、4、5)。 |
| 型鼻-鼻窦真菌病在印度产生重大的疾病负担。虽然确切的数据没有负担,但上升趋势已经指出。因此变得必不可少的利用基于核酸技术快速检测本研究试图画比较传统和分子诊断工具来促进型鼻-鼻窦真菌病的早期诊断的病例。 |
材料和方法 |
| 进行了前瞻性分析的横断面研究部门的耳鼻喉科学,微生物学和病理学的三级保健医院从2010年11月- 2012年4月。批准的研究机构伦理委员会和知情同意来自病人之前收集的样本。30例,≥15岁与慢性鼻窦炎、鼻息肉病的临床症状和体征的一段超过12周是从医院的耳鼻喉科学部门招募的。任何历史的患者摄入抗真菌的治疗在过去15天被排除在研究之外。30名健康志愿者没有任何历史形成的鼻、鼻窦手术对照组。术前鼻息肉鼻灌洗和peroperatively组织活检样本取自病人,在生理盐水和福尔马林发送到我们医院的实验室。鼻灌洗也来自于健康对照组。 |
| 所有样品都是在层流处理。活检组织用无菌剪刀和切成小块的一部分被温柔的均质在臼研磨,然后接种SDA (Sabouraud葡萄糖琼脂用抗生素:氯霉素- 0.4 g / L;庆大霉素- 0.04 g / L和没有cyclohexamide)和孵化25ºC为4周每周监测之前,被视为对真菌生长不利。直接显微镜检查的组织标本与10%氢氧化钾(KOH)消化后进行筛选真菌元素。识别不同的菌丝的分离是基于宏观特征和乳酚棉蓝色真菌菌落的显微镜检查。组织病理学检查的组织使用Gomori乌洛托品银染色法进行确定真菌菌丝,嗜酸性粒细胞,夏科layden晶体,炎症细胞和其他组织入侵的证据[6] |
| 此外,组织和灌洗后受到PCR DNA样本提取使用商用DNA提取工具包(表达载体Purelink基因组DNA装备,美国)按照制造商的指导方针。组织样品在液氮快速冻结援助溶解。从提取的DNA是利用PCR引物对如下所示。 |
| Panfungal基因[7]:正向引物- 5´GAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC 3´ |
| (501个基点)反向引物- 5´CCGATCCCTAGTCGGCATAG 3 ' |
| A.flavus基因[8]:正向引物- 5 'cgacgtctacaagccttctggaaa3 ' |
| (200个基点)反向引物- 5 'cagcagaccgtcattgttcttgtc3 ' |
| panfungal底漆有针对性的高度保守的地区包括真菌王国的成员念珠菌、曲霉菌、镰刀菌素、双晶的真菌和接合菌群,主为每个反应混合物混合25μl准备2.5μl的缓冲区,0.75μl混合核苷酸(10毫米),0.75μl MgCl2(50毫米),0.5μl Taq DNA聚合酶(5 u /μl), 1.0μl (100 pmol)的每一个正向和反向引物(美国σ)和蒸馏水来弥补体积。埃普多夫管热循环仪放入(埃普多夫mastercycler梯度,德国)。热循环参数如下:最初在94°C变性5分钟,35周期在94°C的变性1分钟,在60°C (Panfungal基因和退火黄曲霉基因45岁),在72°C扩展1分钟和最后一个在72°C扩展7分钟。 |
| PCR产品受到三乙酸作为运行在1.5%琼脂糖凝胶电泳利用缓冲区,和可视化ethidium -溴化染色检测紫外线照射下。 |
| 通过SPSS统计数据分析了17。一维方差分析测试图基测试是用于比较分析。 |
结果 |
| 总共30例临床疑似CRS拥有一个平均年龄为29.06(南达科他州‡2)年包括在这项研究中。大部分患者(96.66%)出现鼻塞。其他常见症状包括鼻涕(73.33%)、嗅觉减退(56.66%)、头痛(53.33%),表现症状持续时间范围从3-11月19/30例(63.33%)。其他患者遭受投诉超过1 - 2年。6/30(20%)的患者鼻窦手术的过去历史。 |
| 真菌的慢性鼻窦炎患者:考试,14/30(46.66%)鼻息肉阳性发现菌丝直接KOH显微镜检查和13/30(43.33%)是积极的文化。与积极的KOH 14息肉样品检查,一单独未能发展文化。没有30鼻腔灌洗样品透露任何真菌元素在KOH考试,然而在真菌的5例病例孤立的文化。 |
| 聚合酶链反应:真菌DNA检测在10/30(33.33%)鼻息肉样品通过使用panfungal PCR引物。其中6是积极的文化对真菌生长而4还是文化负面的。7这些10样本进一步检测呈阳性黄曲霉使用该物种特定引物a&1b(图1)。 |
| 图1:Agrose凝胶电泳显示放大的代表样本慢性鼻窦炎的病人使用黄曲霉特定的引物。巷M代表100个基点DNA阶梯,巷1显示了积极的放大控制大小200个基点。巷2、5、7、10显示一个乐队从鼻息肉样200个基点。巷4 9显示一个乐队分别为200个基点从鼻腔灌洗。巷11显示了消极的控制。 |
| 图1 b:Agrose凝胶电泳显示放大的代表样本慢性鼻窦炎的病人使用Panfungal引物。巷M代表100个基点DNA梯相比之下,巷1是消极的控制,巷2显示了积极的放大控制大小501个基点,巷3、6显示一个乐队在501个基点从鼻息肉样和巷8、10显示一个乐队从鼻腔灌洗样品501个基点。 |
| 聚合酶链反应的敏感性和特异性分别为45.45%和61.53%。使用Panfungal PCR引物在鼻腔灌洗能证明存在的真菌在12的30个样品只有4是积极的文化,被确认为10/12A.flavus。鼻灌洗的健康对照组并没有透露任何真菌菌丝直接KOH考试。文化样本阳性对照组的7/30A.flavus。使用panfungal PCR引物也积极的在上面7控制(表1)。 |
| 患者的组织病理学CRS(表2:图2)所示 |
讨论 |
| 真菌的潜在作用的鼻子和窦腔尚不清楚。在一些它只是作为一个正常菌群的一部分,存在于其他它作为一种病原体引起型鼻-鼻窦真菌病[9]。型鼻-鼻窦真菌病一种疾病,其特点是鼻子和副鼻窦真菌,已经成为一个越来越认可实体在过去的十年。它可以区分为非侵入式和侵入性形式基于缺乏/真菌在鼻窦粘膜的存在。型鼻-鼻窦真菌病的治疗和预后不同于其他柜台部分变得非常重要,正确诊断和区分真菌和细菌和其他原因的CRS[3]。研究从而进行比较PCR和真菌文化识别患者真菌CRS也研究的出现频率A.flavus和其他真菌CRS的代理。 |
| 相比其他研究在印度Chakravarti et al即真菌性鼻窦炎是更常见的在年轻的成年男性[10],我们的研究并没有显示任何性别偏好。这可能是由于更多的暴露在外部干热的环境和真菌制剂与允许他们感染副鼻窦黏膜受伤并导致慢性炎症。在伊朗和埃及和其他研究,我们的箱子也出现鼻塞,鼻涕和嗅觉减退的主要表现症状(11、12)。 |
| 在目前的研究46.66%和43.33%的情况下是积极的对KOH和文化考试分别为鼻息肉。略高隔离率一直在观察其他研究(13、14)。这通常差异可能是由于蛋白质公布的嗜酸性粒细胞的粘蛋白有毒真菌和可能会干扰他们的生长培养基[11]。 |
| 鼻息肉病例总数的10/30(33.33%)的被使用panfungal引物PCR阳性菌6可能是孤立的文化,和其余4不能生长。因此PCR能够探测到额外的4例(13%),错过了在文化尽管真菌检测的临床相关性作为殖民者或病原体的CRS这些患者需要确定。然而,敏感性(45.45%)和特异性(61.53%)通过PCR相比少了文化(81.81%;和76.93%)。可能的原因可能是由于困难的真菌从组织中提取DNA相比其他样品和PCR抑制剂存在于组织样本可以干预,从而损害真菌的PCR检测。这些发现是一致研究Kostamo et al PCR在哪里声明加速真菌的检测鼻/窦样品但并不总是增加型鼻-鼻窦真菌病诊断的准确性(15、16)。粘蛋白过敏的组织病理学表现真菌菌丝在真菌培养和PCR与积极性。 |
| 鼻灌洗样品收集在我们的研究中显示,16.66%积极性真菌文化但是没有发现在KOH与菌丝。此外4(80%)的这些也看好PCR,除了其中一个的样品对PCR但仍负面文化是积极的。文化积极的鼻腔灌洗样本比得上工人来自韩国,Viennna和纽约[5,13日17]。无法发现任何菌丝在KOH考试可以是由于真菌的最小数量元素出现在鼻腔灌洗样品进一步得到稀释由于存在20毫升生理盐水用于清洗样品。尽管离心这将使检测菌丝不确定。 |
| PCR在鼻腔灌洗样品有积极性的40%以上,获得这些样本。文化是一致的其他研究也报道提高检测率,利用PCR作为诊断工具在鼻腔灌洗样品(3、4、5)。因此PCR绝对是更敏感的鼻灌洗样品检测真菌的元素。 |
| 在我们的研究中曲霉属真菌是主要的真菌生长在文化。答:flavus构成了大部分的增长来自息肉样本,也观察到PCR。缺乏demateacious真菌或混合真菌生长是一个明显的观察在我们的研究中,虽然A.fumigatus是生长在一个样本。剩下的30%息肉样只有panfungal PCR阳性。这个发现在我们的研究不仅是类似于其他研究在印度(18 - 20),但在伊朗和沙特阿拉伯,研究A.flavus据报道是最常见的真菌剂引起鼻窦炎(11、21)。健康对照组的7也显示的增长A.flavus在鼻腔灌洗样品表明真菌可以存在健康鼻植物的共生体。的原因A.flavus主导的这一部分国家相比dematiacous集团主导的西方可以归因于在印度炎热和潮湿的气候条件普遍倾向于真菌的生长。研究表明,曲霉属真菌是最常见的空气真菌孢子在室内和室外环境将促进这些真菌。另一个因素可能与住房的类型在温暖的地区通常开放环境和开放式风格,会导致长时间暴露于真菌[18]。 |
结论 |
| 诊断疑似病例的病因代理型鼻-鼻窦真菌病,不仅需要高指数的临床怀疑但彻底微生物和病理样本的工作。PCR在鼻息肉/灌洗样品显示了有前景的结果,因为它有能力检测甚至微量DNA,如果出现在样本周转时间短。因此它给我们一个有吸引力的和有前途的替代文化。然而我们的研究结果表明,由于真菌DNA提取困难息肉,取代聚合酶链反应可能不是谨慎的文化。但这可能不是真正的洗胃样品PCR已不可否认证明更好的结果。这CRS患者方面有明显的优势,我们可以使用鼻腔灌洗的早期检测真菌的存在。 |
表乍一看 |
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| 表1 |
表2 |
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数据乍一看 |
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引用 |
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