研究和评论:植物科学杂雷竞技苹果下载志》上
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ISSN: 2320 - 0189
+ 1-845-458-68821国家资源库,研究所作物科学年代,中国农业科学院,北京100081,中国
收到日期:12/05/2016接受日期:13/07/2016发表日期:15/07/2016
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最近的冷冻保存技术的进步极大地增强了我们的知识的无性繁殖作物的低温贮藏和recalcitrant-seeded物种。各种种类的佩妮(佩妮×矮牵牛Vilm)。使用流行的园艺植物和作为植物分子生物学研究的模式系统。一项研究在传统低温贮藏的佩妮悬浮在液态氮可能出现文化体细胞无性系变异细胞,恢复从而迫使低温贮藏技术的发展使用拍摄技巧作为外植体来源。佩妮的芽尖滴低温贮藏协议已经有效地发达,现在四个佩妮登记入册已经成功低温贮藏在中国国家资源库使用这种方法。此外,佩妮分生组织细胞的组织学观察进行通过透射电子显微镜在滴在关键步骤。细胞学反应观察preculture后,加载和PVS2步骤。需要进一步的研究来理解细胞学、生物化学和分子反应的细胞在低温贮藏。
滴玻璃化冷冻保存,佩妮,拍摄技巧,TEM。
低温贮藏,生物材料的储存在极低的温度下蒸气或液态氮(LN, -130°C到-196°C)在维持细胞生存能力和解冻后再生的能力,是一种符合成本效益和空间有效技术(1]。这是目前最有前途的长期储存方法克隆作物和recalcitrant-seeded物种(1]。各种低温贮藏技术的快速发展,已经有超过200种植物成功冷冻保存,包括农作物、树木,观赏植物,野生植物(2,3]。矮牵牛(佩妮×矮牵牛Vilm)园艺植物流行在亚洲,美国,欧洲4]。佩妮种质中可以保存植物花园或体外种质库,例如,四个佩妮品种保存在体外收集中国全国资源库(作物科学研究所,北京);然而,它会消耗大量的时间和劳动力。因此,低温贮藏是一种有效的方法来保护关键的集合无性生殖传播佩妮品种。
佩妮拍摄的超低温保存方法技巧的发展
低温贮藏的佩妮悬浮细胞培养被McLellan报道(5]。然而,悬浮细胞暴露在LN可能表现出体细胞无性系变异后恢复。因此,有必要发展的低温贮藏协议通过拍摄技巧作为外植体来源。的基础上几个玻璃化和vitrification-based技术用于植物(6,7),我们开发了一个滴协议佩妮拍摄技巧(8]。
一些先前的研究已经报道了正交阵列测试对低温贮藏方法的发展作出了重大贡献的动物和植物9- - - - - -11]。在我们的研究中,我们使用正交设计有效地确定每个因素的影响和最优水平,减少了实验的数量。我们以前用正交设计和单因素实验优化康乃馨茎尖低温贮藏过程,并成功地确定五个变量的意义只使用16治疗(12]。在发展的全因子实验设计dropletvitrification协议佩妮拍摄技巧,216治疗组合必须执行。然而,我们成功的3因素,体外植株的年龄(20天),蔗糖的浓度在preculture解决方案(0.2 mol / L),和恢复介质(MS基础培养基13),有一半NH的浓度4没有3,KH2阿宝4,先3和蔗糖),使用基于正交试验array[18治疗8)(图1)。正交实验使我们能够确定初步水平的变量,和后续的单因素实验需要进一步细化具体治疗的水平,并提高整体存活率和再生水平。例如,对于佩妮拍摄技巧,后续单因素实验进行四个变量,即。,the preculture duration, the loading duration, the concentration, and the exposure duration of plant vitrification solution 2 (PVS2 [14))(8]。
图1:亚文化的影响,蔗糖的浓度在preculture解决方案中,preculture持续时间、加载时间、PVS2暴露时间,恢复介质在低温贮藏后再生百分比基于正交阵列。水平的治疗:亚文化时间(25日20或15天),蔗糖的浓度在preculture解决方案(0.2米、0.3米或0.5米),preculture持续时间(0,3或5天),加载时间(20、30或40分钟),PVS2暴露时间(10、20或30分钟),恢复培养基(MS,补充0.5毫克/升BA女士和女士补充825毫克L1NH4没有3,85 mg / L KH2阿宝4,950 mg / L KNO3和15 g L1蔗糖)。
因此,在优化滴协议,佩妮拍摄技巧是从20-day-old切除体外植株和precultured女士与0.2 mol / L的液体培养基中蔗糖溶液为2天。随后,pre-cultured拍摄技巧与加载解决方案孵化30分钟,然后脱水在PVS2 30分钟在0°C。最后,对待拍摄技巧被冻滴PVS2解决方案放在铝箔条,然后迅速沉浸在LN。低温贮藏拍摄技巧然后再与1.2 mol / L MS的液体培养基中蔗糖和再生的恢复中。四个佩妮品种测试通过使用这种优化滴协议显示平均生存和再生百分比从67% - 80%,-95%和54%。遗传稳定性的评价,使用简单重复序列标记,这些品种在低温贮藏过程中显示没有基因变化。这些结果表明,滴的方法将有利于项目的发展为长期保护佩妮种质基因库。目前,对于每一个品种,100 - 120年拍摄技巧在中国全国资源库低温贮藏(中国,北京)。
透射电镜下分生组织细胞的细胞学反应低温贮藏过程
在玻璃化,分生组织细胞的拍摄技巧必须足够脱水由于沉浸在LN(避免致命的伤害2]。许多研究显示pre-culture的重要性,osmoprotection, PVS2治疗成功的低温贮藏(15- - - - - -17]。理解细胞的超微结构变化提供有价值的信息促进低温贮藏期间的解释他们的行为和响应(18- - - - - -20.]。调查分生组织细胞的宽容的佩妮在滴过程中,我们观察到细胞的超微结构变化从佩妮的芽尖品种“妞妞2”在关键步骤使用透射电子显微镜。样本收集和固定用2.5%戊二醛(m / v) 12 h 25°C。固定样本用0.1磷酸盐缓冲剂,其次是1%的四氧化锇,然后洗0.1磷酸盐缓冲剂,并受连续脱水以30%,50%,70%,80%,90%和100%丙酮(v / v)。样本嵌入Epon812聚合,然后切成1μm半薄部分精确定位,最后切成50 - 70纳米超薄部分超微切片机(德国徕卡UC6i)。
结果表明,细胞的宽容与preculture拍摄技巧可能改善,加载和PVS2治疗。preculture后分生组织的拍摄技巧,加载和PVS2治疗,与新鲜的拍摄技巧相比,似乎反应渗透压力(图2)。许多小空泡,线粒体的快速发展,增加异染色质在细胞preculture后,加载和PVS2治疗(图2)。因此,这表明preculture和PVS2治疗是必要的成功cryoprotection LN曝光之前,这也证实了通过正交实验和单因素分析(8]。
图2:在新鲜的芽尖细胞超微结构的观察(A和B)和拍摄技巧preculture后,加载和PVS2治疗(C和D)。图。2 A和2 B细胞的特点提出新的拍摄技巧(没有任何治疗)2μm和1μm的尺度,分别。图2 c和2 d细胞的特点提出拍摄技巧preculture后,加载和PVS2治疗2μm和1μm的尺度,分别。字母代表:CW-cell墙,CM-cell膜,中子核,Ne-nucleus信封,V-vacuole M-mitochondria。
分生组织细胞脱水PVS2解决方案表明,结构保存完整的细胞核,细胞壁,和丰富的细胞器(线粒体、质体等)。所有这些特性表明一个非常活跃的细胞代谢。LN曝光之后,一些细胞复苏期间能够修复损伤和生存文化,而一些细胞广泛受损,致命的受伤。
优化滴方法提供了温和的好再生四个佩妮品种测试。分生组织细胞的超微结构的研究在低温贮藏过程有助于我们理解细胞的应激反应在拍摄技巧。进一步的研究是必要的探讨细胞学、生物化学和分子反应的细胞在低温贮藏。
本研究支持的作物种质资源保护、合作收集技术研究和实践在中国和美国之间的作物资源库(2014 dfg31860),利用特殊授权农业部的农业科技创新项目/作物种质资源保存和分享创新团队(CAAS ASTIP)。
