研究与评论:兽医科学杂雷竞技苹果下载志
菜单e-ISSN号:2581 - 3897
e-ISSN号:2581 - 3897
收到日期:03/09/2018接受日期:08/10/2018发表日期:16/10/2018
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Oshin, Blanch和Lex是三种商业杀虫剂，属于新烟碱类杀虫剂(一种新型农用化学品)。在本研究中，绵羊多形核白细胞(PMNL)暴露在体外不同浓度(100 μM, 50 μM, 10 μM)的三种杀虫剂(Clothianidin, Imidacloprid, Thiamethoxam)，研究它们对吞噬活性、溶菌酶和一氧化氮浓度等选择性免疫参数的影响。在体外将绵羊PMNL暴露于不同浓度的三种农药中2小时，与对照组未处理的细胞相比，吞噬活性下降，呈剂量依赖性。在本研究中，奥辛是毒性最强的新烟碱类杀虫剂。与吞噬活性不同，溶菌酶活性的降低与剂量无关。与其他浓度相比，100 μM剂量的Oshin和漂白处理的细胞溶菌酶浓度显著降低。与10 μM相比，100 μM和50 μM处理的细胞溶菌酶浓度显著降低。100 μM oshin处理细胞的一氧化氮含量明显低于Lex和Blanch处理细胞。在50 μM和10 μM浓度下，Oshin和Blanch处理的细胞间无显著差异。
新烟碱，绵羊，多形核白细胞细胞，溶菌酶，一氧化氮，吞噬作用
如今，由于环境污染，慢性中毒病例比急性中毒病例要多。因持续接触有毒农药污染而引起的消化、泌尿、呼吸和生殖系统疾病是非特异性的，表现为动物免疫系统受损的结果[1，2］．
新烟碱类杀虫剂是使用最多、发展最快和分布最广的一类杀虫剂[3.-5］．新烟碱类杀虫剂已开始取代拟除虫菊酯、氯化碳氢化合物、有机磷酸盐、氨基甲酸酯和其他杀虫剂[6］．新烟碱是一种乙酰胆碱杀虫剂，会影响昆虫的中枢神经系统，导致瘫痪和死亡[7]并被分类为n -硝基胍类(吡虫啉、噻虫嗪、呋喃和噻虫脒)和n -氰胺类(对乙酰脒和噻虫啉)。它们被广泛应用于各种领域，从用于家畜对抗外来寄生虫的兽药、城市景观美化，以及在许多农业系统中作为作物保护剂[8］．它们具有广谱杀虫活性，在低浓度下也有很高的功效[9］．新烟碱类杀虫剂对许多种类的昆虫具有剧毒，与目前使用的其他杀虫剂类别相比，对脊椎动物的毒性相对较低[10］．
尽管它们被美国环保署[环境保护署，2003]列为哺乳动物低毒性的II类和III类毒素，并标有“警告”或“警告”的信号字[11]但在2013年，欧盟限制了一些新烟碱类药物，其使用因其对环境的影响而受到越来越多的安全保护[12并禁止在室外使用某些新烟碱类杀虫剂(氯噻尼丁、吡虫啉和噻虫嗪)。以往的研究表明，吡虫啉是比有机磷和氨基甲酸酯更常用的杀虫剂之一，对雄性白化大鼠具有明显的免疫毒性[13，14]、小鼠及大鼠骨髓细胞[15，16]，此外，吡虫啉可导致人血淋巴细胞DNA链断裂[17]和白细胞。由于新烟碱类杀虫剂是一类新型农用化学品，对不同类群的新烟碱类杀虫剂及其对反刍动物免疫系统的影响的研究尚不清楚。
在本研究中，我们研究了三种不同类型的新烟碱对免疫系统参数的影响，它们是Oshin(活性成分为呋喃呋喃)、Blanch(活性成分为噻虫啉)和Lex(活性成分为噻虫嗪)。新烟碱暴露在实验室组织培养实验中进行，包括3种亚慢性剂量(100 μM、50 μM和10 μM)。我们选择了三个已建立的免疫参数进行分析，即PMNL的吞噬活性、溶酶体浓度和一氧化氮浓度。
实验设计
在这个实验中，绵羊被用作反刍动物的模型，这种反刍动物在埃及广泛分布和食用。
实验进行了在体外多次测量。每种新烟碱的每个浓度分配在三个重复的试管中，例如，10 μl噻虫嗪的浓度重复分配在3个试管中，每个试管分别分析并记录数据。整个实验重复了两次，得出最终结果。
农药制剂
本研究主要从新烟碱类杀虫剂开始使用三种农药;Thiamethoxam (C8H10ClN5O3.S)分子量291.7147，商用化称为Lex，含活性物质25%，噻虫啉(C10H9ClN4S)分子量252.74商业上称为焯水，含活性物质48%，呋喃(C7H14N4O3.)分子量202.211，商业上称为奥辛，含活性物质20%。每种农药分别配制了100 μM、50 μM和10 μM三种浓度。用无菌生理盐水配制不同浓度的农药，在玻璃管中加入吞噬细胞和细菌后调整至最终浓度为100、50和10 μM
细菌的准备
金黄色葡萄球菌细菌培养在营养琼脂上。将细胞收集到HBSS上，用10%的同系血清在37˚C下调理1小时，频繁摇晃，洗涤两次，将球粒悬浮在1 ml不含苯酚的RPMI中，用RPMI调整分光光度法使最终浓度为7.5 X 105 cfu/ml。
噬菌作用的测定
修改原测定法后进行的测定[18］．在消毒玻璃管中，每种农药浓度各取1毫升，加入1毫升PMNL细胞，在37˚C下孵育，并频繁摇晃。正好孵育一小时后，一毫升金黄色葡萄球菌在每个试管中加入细菌，使PMNL: cfu为1:15。控制管制备含有PMNL和金黄色葡萄球菌只有。试管继续孵育2小时，并经常轻轻摇动。在孵化期结束时，从每个试管中取出样品，铺在玻璃显微镜载玻片上，用甲醇固定，用吉姆萨染色进行显微镜检查。共50个吞噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌每一张幻灯片都被计数。
一氧化氮浓度测定
一氧化氮的测定根据[19］．简单地说，每个样品100 μl转入平底96孔ELISA板，Griess试剂(0.5%磺胺;在2.5%磷酸(Mereck Co.)和0.05% N-(1-萘基)二盐酸乙二胺(Sigma Co.)。混合物在21°C下孵育10分钟。在570 nm处，使用ELISA阅读器(Dynatech MR7000;Dynatech Laboratories Inc)。通过与亚硝酸钠(Sigma Co.)标准曲线的吸光度值进行线性拟合，将测试样品的吸光度转换为亚硝酸盐的微摩尔。
溶菌酶浓度测定
溶菌酶测定参照Peerters和Vantrapen [20.］．简单地说，将1%琼脂糖溶解在0.067 M PBS中，pH为6.3，加热至100°C完全溶解，然后冷却至60°C-70°C, 500 mg均匀悬浮微球菌lysodeikticus在5毫升生理盐水中加入1升琼脂糖，混合均匀。将板以4毫米深的厚度倒入，然后冷却，并在琼脂糖中切割直径2毫米的井，排成4 × 4行，间隔15毫米。检测时，在室温下取培养皿、血清样品和标准溶菌酶溶液。每种血清样品各取25 μl，置于2孔中，用标准溶菌酶溶液进行同样的处理。培养皿室温孵育12-18小时。每口井周围间隙区的直径被测量到最接近0.1 mm。建立了溶菌酶标准液在3、15、30、60和120 μg/ml浓度下的标准曲线。浓度的对数在半对数图上与相应的清除区域的直径作对比。
绵羊PMNL细胞的吞噬活性(图1)显著受本研究中使用的每一种新烟碱浓度的影响。吞噬活性下降呈剂量依赖性。在这项研究中，奥辛碱是抑制新烟碱的最强成分(数据未显示)。
图1:不同浓度3种neoctinoids存在时绵羊PMNL的吞噬活性。同一组内不同字母上标差异有统计学意义(P<0.05)。
在100 μM下，Lex和Blanch的吞噬活性有显著差异(图2)．同时，在50 μM和10 μM浓度下，奥辛与Blanch和Lex均有显著差异。
图2:3种不同浓度新烟碱对绵羊PMNL吞噬活性的比较。除其他2种新烟碱类外，各浓度的奥辛碱均显著降低了小鼠的吞噬活性。
在对照组和本研究中使用的三种新烟碱之间观察到显著差异。与吞噬活性不同，溶菌酶活性与剂量无关(图3)．Oshin组和Blanch组仅在100 μM剂量时溶菌酶浓度较其他浓度显著降低。在Lex组，100 μM和50 μM显著降低溶菌酶浓度。
图3:不同浓度3种新烟碱存在时绵羊PMNL溶菌酶活性的研究。同一组内不同字母上标差异有统计学意义(P<0.05)。
在100 μM浓度和50 μM浓度下，Lex与Oshin和Blnach均有显著差异，仅Blanch与Lex有显著差异(图4)．3种新烟碱在10 μM浓度下无显著差异。
图4:3种不同浓度新烟碱对绵羊PMNL溶菌酶活性的比较。
本研究中使用的各新烟碱类化合物浓度的增加显著影响绵羊PMNL细胞的一氧化氮活性。一氧化氮活性下降呈剂量依赖性(图5)．
图5:不同浓度3种新烟碱存在时绵羊PMNL一氧化氮活性的变化。同一组内不同字母上标差异有统计学意义(P<0.05)。
100 μM时，Oshin与Lex、Blanch差异显著(图6)．在50 μM和10 μM范围内，Lex与Blanch、Oshin均有显著差异。在50 μM和10 μM浓度下，奥辛碱和白开水无显著性差异。
图6:3种不同浓度新烟碱对绵羊PMNL一氧化氮活性的比较。
健康相容的免疫防御系统对动物的健康至关重要。环境因素可能会使动物更容易接触寄生虫和病原体，从而削弱这种防御能力。环境污染是影响动物养殖场正常免疫系统的一个不利因素，世界各地的农作物和动物都需要使用杀虫剂来对抗动植物病原体。不幸的是，这些杀虫剂也对牲畜有害。杀虫剂污染的环境对牲畜的生命系统有负面影响。
免疫系统是一个敏感而复杂的系统，负责在健康动物体内击败病原体。吞噬活动是免疫系统中第一个也是至关重要的活动，它负责吞噬和降解入侵的病原体，并将其呈现给免疫系统的其余部分以中和病原体。主要是多形核白细胞(PMNL)是一组白细胞，负责吞噬活动。抑制PMNL活性可使动物无法正常对抗病原体。
新烟碱类农药是新一代农药。本研究中使用的三种新烟碱类化合物(诺特呋喃组的Oshin，噻虫啉组的Blanch和噻虫妥嗪组的Lex)操纵了多态核白细胞活性。每种农药的三种浓度对绵羊的吞噬活性进行了测试在体外显示剂量依赖性显著降低这种活性。100 μM剂量越大，对吞噬细胞的抑制作用越明显，50 μM剂量次之，10 μM剂量对吞噬细胞的抑制作用最低。暴露于新烟碱类杀虫剂可抑制蜜蜂对感染的免疫反应[21]和[22]， fish [23]和鸟[24］．也在[25]，报道了口服吡虫啉(与噻虫啉具有相同的化学结构)给雌性小鼠，与对照组相比，治疗组小鼠的一些细胞和肱骨免疫参数明显降低。在蜜蜂中也有类似的结果，据报道，增加接触新烟碱类化合物(噻虫啉、吡虫啉和衣thiandin)会降低免疫参数[26］．
奥辛对绵羊PMNL吞噬活性的抑制作用最强，特别是在50 μM和10 μM时。三井化学公司(日本东京)商业化的第三代新烟碱类杀虫剂呋虫胺可能是公共卫生领域有用的候选杀虫剂，因为它对哺乳动物毒性低，对广泛的害虫具有很强的杀虫活性。同时对免疫系统有不良影响，抑制吞噬作用。先前对恐龙呋喃的研究表明，它通过影响神经和免疫系统(降低脾脏和胸腺重量)对哺乳动物具有毒性[27］．
许多研究人员认为，溶菌酶是一种抗菌酶，由于其有效性和广泛存在，是非特异性肱骨免疫机制中最重要的组成部分之一[28］．
三组细胞溶菌酶浓度均显著低于对照组。在100 μM浓度下，Lex与Oshin和Blanch均有显著差异。在50 μM浓度下，Blanch和Lex之间差异显著，10 μM浓度下3种新烟碱类之间差异不显著。木村黑田等人。[29研究表明，那些不可逆地与特定受体结合的化学物质(新烟碱类、基因毒性致癌物和一些类金属)，无论接触水平有多低，都会以时间依赖的方式产生毒性作用。新烟碱类化合物的这种影响可以从基础神经科学研究中得到证明，即新烟碱类化合物对哺乳动物神经元和无脊椎动物神经元都有影响，并且对脊椎动物中烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)的影响比农药公司最初所述的更为显著。蔡等人。30.-32]的研究证明了nachr与免疫系统之间的联系，并表明新烟碱类杀虫剂在暴露的人类细胞中充当自由基的来源，其中ROS(活性氧)高度反应并产生细胞损伤。
一氧化氮(NO)是一种重要的抗感染性生物的毒性防御分子。先天免疫系统细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞利用模式识别受体识别与病原体激活的巨噬细胞相关的分子模式，然后通过释放包括NO在内的多种分子来抑制病原体的复制。
与对照组相比，本研究中应用新烟碱(Oshin、Thiamethoxam和Thiacloprid)可显著降低组织培养中一氧化氮的产生(p<0.05)。一氧化氮浓度下降呈剂量依赖性。这一结果与研究不一致[33]证实吡虫啉可诱导大脑中一氧化氮合酶的三种亚型(iNOS、eNOS、nNOS)和肝脏中两种亚型(iNOS、eNOS)的mRNA转录。吡虫啉暴露导致血浆、大脑和肝脏中一氧化氮生成和脂质过氧化显著增加。虽然两种组织中的超氧化物生成酶黄嘌呤氧化酶活性均升高，但髓过氧化物酶活性仅在肝脏中升高。暴露后，抗氧化酶活性表现出不同程度的变化，但在大脑中检测到抗氧化谷胱甘肽水平显著降低。吡虫啉引起慢性炎症的证据是肝脏和大脑中促炎细胞因子如TNF-a、IL-1b、IL-6、IL- 12和IFN-c的诱导。综上所述，慢性吡虫啉暴露通过改变抗氧化系统和诱导非目标生物肝脏和中枢神经系统的促炎细胞因子产生引起氧化应激和炎症。使用类烟碱增加了一氧化氮，在鲤鱼中也观察到了同样的结果。
结果表明，低浓度的三种新烟碱类杀虫剂(Oshin, Blanch和Lex)会对免疫系统造成损害。在PMNL细胞的吞噬活性受损和受影响细胞释放的杀伤分子(即溶菌酶和一氧化氮)减少中观察到免疫系统的损伤。对吞噬活性影响最大的是奥辛。这些结果有助于这些杀虫剂对环境的毒理学研究，也是对动物健康的一个危险因素。与这些杀虫剂有关的免疫系统危害的证据强调，有必要对农业工人进行教育，以减少在农业中使用这些化学品。
作者声明利益冲突。
