冠状茎提取物对癌细胞的细胞毒作用

Majid Honari¹阿克拉姆·特拉尼法德²^＊Mahdi vazirian说^3.， Ali Salaritabar⁴——哈桑·萨纳提⁴阿里雷扎·马吉德·安萨里⁴

¹伊朗伊斯兰阿扎德大学拉希詹分校海洋生物技术系

²伊朗伊斯兰阿扎德大学拉希詹分校海洋生物学系

^3.伊朗德黑兰医科大学药学系和药用植物研究中心

⁴综合肿瘤科乳腺癌伊朗德黑兰ACECR研究中心

*通讯作者:: Akram Tehranifard
海洋生物学系
伊斯兰自由大学拉希詹分校
Lahijan,伊朗
电话:+ 989111446299
电子邮件: (电子邮件保护)

收到日期:2017年2月16日接受日期:2017年2月28日发表日期:2017年3月5日

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摘要

在这项研究中，细胞毒性不同分数的影响涡轮coronatus用MTT法测定了提取物对乳腺癌细胞株MDAMB468和T47D以及动物(NIH/3T3)和人(MCF10A)正常细胞株的影响。提取软体动物(涡轮coronatus)，在96%乙醇中浸渍72h，得到的提取物被分成氯仿、乙酸乙酯和剩余甲醇的馏分。在24、48和72小时内，用不同浓度的乙醇提取物和馏分对培养的正常细胞和癌细胞进行处理。经50%细胞致死浓度(LC50)测定，乙酸乙酯部分对MDA-MB468细胞株的作用最强(LC50 = 12.04 μg/ml±1.61 μg/ml)，氯仿部分对T47D细胞株的作用最强(LC50 = 19.77 μg/ml±9.97 μg/ml)。从选择性方面考察了提取液和各馏分对所有细胞系的影响，没有一种馏分对乳腺癌细胞系比正常细胞系有特异性作用(选择性指数<3);而在比较动物法系细胞作用的情况下，预计某些组分的相对特异性作用。虽然所研究的酒精提取物和馏分对三种癌细胞系的细胞毒性作用相当大，但这些提取物和馏分对正常细胞系的影响也相当大。因此，只需考虑所研究的组分中现有有效化合物的比电导即可癌组织，这种软体动物中存在的有效化合物可以在未来的研究中更多地考虑用于乳腺癌的治疗。此外，对于细胞毒作用的具体研究，似乎最好使用正常的人系而不是正常的动物系。

关键字

癌症,涡轮coronatus，细胞毒性，细胞系

简介

当身体某个部位的细胞开始不受控制地增殖时，癌症就开始了。癌症有不同的类型，但它们都是因为不正常的不可控的细胞生长而发生的。根据美国癌症协会的一项研究，癌症是美国第二大死亡因素。如今，数以百万计的人正在或一直患有癌症。1]。近年来，除毒素外，还有许多不同的生物活性物质海洋动物提取如滋补品、海绵、软珊瑚、海兔、裸鳃、苔藓虫、刮刀虫及其他海洋动物[2]。

涡轮coronatus它也被称为皇冠月亮头巾蜗牛，1924年在萨米斯湾被发现，但现在它分散在印度-西太平洋，从东部和南部非洲到马来西亚，从日本的北部到南部，从南部到印度尼西亚。它居住在悬崖的潮汐区，以微小的藻类和植物为食。地壳的最大长度为5.5厘米。它生活在悬崖和鹅卵石之间，或在潮汐缝中[3.]。福克纳说，研究人员已经分离出7333种天然海洋产品，包括藻类25%，海绵33%，腔肠动物如海鞭和软珊瑚10%，其余24%是从无脊椎动物如酸(也称为被囊动物)，背鳃螺旋贝类如海兔子，棘皮动物如海星和海参和苔藓动物中分离出来的[4]。

Nabipour等在一篇综述中报道，在波斯湾的611种软体动物中，有172种是生物活性化合物，在波斯湾的8种软体动物中报道了抗癌物质和细胞毒性的分离纯化[5]。Zandi et al. Bushehr医科大学鉴定、提取并纯化了波斯湾海鳗(Aplysia dactylomela)分泌的63 kDa紫色蛋白，具有抗癌作用。纯化蛋白63 kDa在浓度为0.5 μg/ml ~ 1.5 μg/ml时可抑制癌细胞的生长和增殖，特别是NB4细胞株[6]。

材料与方法

样品收集

总共2公斤软体动物涡轮coronatus于12月在位于东经54°53′(格林威治子午线)和北纬26°33′地理坐标的班达尔·朗格潮汐区收集。样本被装在海水容器中运往班达尔朗格的软体动物研究中心，用于鉴定和确认其种类。然后将样品在海水水族箱中存活，直到提取时间。

馏分的提取与制备

提取时，从壳中提取的Turbo软组织250 g(在96%乙醇中，以防止壳提取后体解析酶的诱导)压碎后转移到2 L分离器中，用400 ml 96%乙醇提取3天，重复3次。所得到的萃取液每次从分离器中排出，用旋转蒸发器干燥。研究了1 g干燥提取物的细胞毒作用。剩下的提取物分别用氯仿、乙酸乙酯和甲醇溶剂固相洗涤，直到废液颜色变淡，用薄层色谱确认试验完成馏分的制备。每个组分在通风柜下避光干燥，并保存在冰箱(-18°C)中，直到用于研究细胞毒性作用的时间。

MTT法研究细胞毒作用

细胞系乳腺癌(T47D和MDA-MB468)、正常动物(小鼠成纤维细胞，NIH/3T3)和人正常(正常乳腺上皮细胞，MCF 10A)购自伊朗巴斯德研究所的细胞库。所有使用的高压灭菌元件在研究前均经高压灭菌器(温度120℃，压力20磅/平方英寸)灭菌。用RPMI-1640培养基培养细胞，最终制备的培养基pH为7.2。培养基用过滤装置和0.22微米的滤纸在无菌的Erlenmeyer烧瓶内，在生物罩室和4°C冰箱充分消毒条件下灭菌。

用缓冲液PBS(磷酸盐缓冲盐水)作为胰蛋白酶作用前的漂洗溶剂，使用trypsin - edta稀释剂，用青霉素/链霉素混合物(Gibco-USA)防止培养基微生物污染，用5% trypsin - edta混合物(Boehringer-Germany)分离细胞连接，用螯合剂连接干扰胰蛋白酶作用的钙镁离子。为保证无污染，将培养基放入培养箱24小时，确保无污染后放入4℃冰箱。为了细胞的培养和增殖，在培养基中加入20%的胎牛血清(FBS)。血清在5°C水浴中浸泡20分钟后用于灭活。(默克-德国)配制浓度为5 mg/ml的MTT粉(PBS中)加入细胞培养基中，-20℃保存。

为了进行细胞毒性试验，在每个96孔板中培养104个细胞，并在培养箱中培养24小时。然后，耗尽上介质，每孔用PBS冲洗两次。然后在每孔中加入之前在5 DMSO溶剂中制备的不同分数浓度的200 μl，孵育24小时。每孔加入浓度为5 mg/ml的溶剂MTT (dimethylthiazol -2-yl-2,5-diphenyltetrazolium溴化铵)(Sigma-Germany) 22 μl，在37℃培养箱中孵育4小时。空出各孔上培养基，每孔加入100 μl二甲基亚砜DMSO溶解福马zan结晶，置于培养箱中3-4小时。然后，使用ELISA-reader设备在450nm波长下读取每个孔的光密度，并使用以下公式计算每种浓度的细胞存活率[7]。

细胞存活能力=100 × (OD样本)/ (OD对照)

为了计算死亡率，上面的结果减去100，为了确定导致一半细胞死亡的浓度水平(LC50)，使用了浓度与细胞死亡水平的图表。在浓度为0.1、1、10、100、1000和10000微克/毫升的酒精提取物和氯仿和甲醇馏分下对研究细胞进行24、48和72小时的处理，乙酸乙酯馏分浓度为0.07、0.7、7、70、700和7000 μg/ml。每个实验重复5次，结果以均数±标准差表示。本研究所得数据采用单向方差分析(ANOVA)。在0.05概率水平上确定差异显著，采用单因素数据均数方差分析和Tukey检验博士后进行组间数据差异的显著性检验。所有数据均采用SPSS软件进行统计分析，数据差异以alpha=0.05为显著性水平。

为了确定预期提取物和细胞系的特异性，使用了动物(NIH/3T3)和人(MCF10A)正常细胞;乳腺癌细胞系(包括T47D和MDAMB468)的提取物和部分的LC50值被划分为正常细胞的LC50值和部分。如果结果数(正常细胞LC50 /癌变细胞系LC50)大于3，则表明对癌细胞系具有相对特异性作用[8]。

结果

本文综述了醇提物及其组分的细胞毒作用表1．经统计计算，在相同治疗时间下，不同组间的数据结果差异有统计学意义。此外，为了考察提取物及组分对不同正常细胞系的影响差异，统计检验表明，动物和人类类别的影响水平存在显著差异。

样本	MTT试验
样本	MDA-MB468	T47D	NIH / 3 t3	MCF10A
氯仿萃取	36.84±11.78	19.77±9.97	10.00±2.36	0.4±0.03
甲醇分数	23.88±7.37	12.46±2.54	52.71±14.80	2.25±0.01
乙酸乙酯馏分	12.04±1.61	28.23±5.60	26.96±8.90	2.31±0.03
提取	27.87±12.95	40.68±13.38	26.00±2.96	1.70±0.03

表1。提取物及不同部位的细胞毒作用t . coronatusMTT法对肿瘤和正常细胞系的影响数字代表信用证₅₀取值与μg/ml。

讨论

发现主要影响细胞毒作用的新型抗癌化合物的一个重要案例是关注这些药物的副作用，这是通过抗癌药物的特异性获得的。近几十年来，关于海洋生物的细胞毒性作用的报道，对具有相当抗癌作用的新化合物的研究正在增加。对海洋软体动物的细胞毒作用进行调查，并将所考虑的作用与其他有关海洋软体动物的类似研究进行比较，结果显示所研究的物种对正常细胞和癌细胞具有很强的细胞毒作用(表2)．然而，目前的研究是在癌细胞或正常细胞上进行的，而不是在两种细胞上进行的。Petit等人对Turbo stenogyrus 1至4的细胞毒性作用进行了研究。该实验是在不同的癌细胞系上进行的，基于P388的GI50(来自最大细胞增殖抑制的50%浓度)(淋巴细胞性白血病)为0.25 μg/mL。Petit等人对乳腺细胞系(MCF7)的GI50值为0.4 μg/mL [9]。

被研究的生物	所研究的提取物/馏分	研究癌症或正常细胞系	报告LC50(µg/ml)
Anadara rhombea[10]	甲醇提取	加拿大皇家银行	60.9±1.8
牡蛎属edulk[11]	纯粹的提取	加拿大皇家银行	63.7±2.4
Arca granosa[12]	水提物	MCF-7	0.59±0.17
Mercenaria[13]	纯粹的提取	bgc - 823	0.16±0.003

表2。比较以往研究中所调查的软体动物对不同系癌细胞和正常细胞的细胞毒作用。

将所研究的提取物及组分对两类正常细胞的影响进行统计学比较，结果表明，这些数据之间存在显著差异。此外，通过对正常细胞与正常人体细胞相比对癌细胞的特异性作用的研究，没有一种提取物或馏分对癌细胞系(LC50正常/LC50癌症<3)表现出特异性作用。在比较甲醇馏分对正常动物系NIH/3T3和正常人类系(MCF10A)的细胞毒作用时，特别报道了甲醇馏分对某些癌症系的作用(LC50N/ LC50C>3)。因此，虽然世界各地的许多研究都使用NIH/3T3线来研究抗癌药物在体外培养基中的特异性，但似乎使用正常人类细胞以更现实的形式代表了细胞毒性化合物作用的特异性。

将以往研究的结果和方法与本研究进行比较，本研究在考察一种海洋软体动物与正常系对癌细胞的细胞毒作用，以及在考察正常系与动物系特异性指数的价值时，说明了用正常的人类细胞系代替动物细胞系的价值和地位，并说明了软体动物细胞毒素的显著作用涡轮coronatus．

结论

96%酒精提取物和软体动物部分的细胞毒作用涡轮coronatus在两个细胞系上乳腺癌细胞已相当多。然而，该提取物及组分对正常细胞系的影响也相当大，且与对癌细胞系的影响有显著差异。因此，只有通过将所研究的部分中有效化合物的特定指导加入到癌症组织中，这种软体动物中现有的有效化合物在未来可以更多地用于乳腺癌的治疗。

建议

更多的纯化对肿瘤细胞系有更特异作用的有效组分(特别是氯仿组分)，以达到主要的有效化合物。

研究目的组分在不同方法下的细胞毒作用机制细胞凋亡对细胞的诱导或作用基因组)．

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