细胞毒性的影响涡轮coronatus提取癌症细胞系

Majid Honari¹,Akram Tehranifard²^*,马赫迪vazirian³阿里Salaritabar⁴哈桑Sanati⁴,Alireza博盖安萨里⁴

¹海洋生物技术学系Lahijan分支,伊斯兰自由大学,Lahijan、伊朗

²Depatment海洋生物学,Lahijan分支,伊斯兰自由大学,Lahijan、伊朗

³药店和药用植物研究中心,德黑兰大学医学科学院,德黑兰,伊朗

⁴综合肿瘤科,乳腺癌研究中心ACECR,德黑兰,伊朗

*通讯作者:: Akram Tehranifard
海洋生物学系
Lahijan分支,伊斯兰自由大学
Lahijan,伊朗
电话:+ 989111446299
电子邮件: (电子邮件保护)

收到日期:2017年2月16日接受日期:2017年2月28日发表日期:2017年3月5日

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文摘

在这个研究中,细胞毒性不同分数的影响涡轮coronatus提取在乳腺癌细胞系MDAMB468 T47D和动物(NIH / 3 t3)和人类正常细胞系MCF10A)通过MTT法进行调查。提取mollusck (涡轮coronatus)浸渍(72 h)是在96%乙醇和由此产生的提取分为分数的氯仿,乙酸乙酯和甲醇。治疗期间执行正常和肿瘤细胞培养时间跨度的24日,48和72小时不同浓度乙醇提取和分数。后确定的致死浓度50%的细胞(LC50),乙酸乙酯部分对细胞系的影响最强烈MDA-MB468 (LC50等于12.04μg /毫升±1.61μg /毫升)和氯仿部分对细胞的影响最强的线T47D (LC50等于19.77μg /毫升±9.97μg /毫升)。提取和分数在所有线路的影响也是调查的选择性和分数都没有具体的影响比法线的人类乳腺癌癌症细胞系(选择性指数< 3);在对比的情况下动物法线细胞的影响,相对特定的一些分数是预期的效果。而细胞毒性研究酒精提取和分数的影响在三个癌症细胞系是相当大的,这些提取的效果和分数正常细胞系也相当大。因此,只有考虑现有有效化合物的电导率研究分数癌组织,有效的化合物存在于这个软体动物可以更多的考虑在未来研究用于乳腺癌的治疗。同时,似乎为特定的细胞毒性效应的调查,最好是使用正常的人类,而不是正常的动物。

关键字

癌症,涡轮coronatus,细胞毒性,细胞线

介绍

癌症开始时细胞体内的一部分开始无法控制的扩散。有不同类型的癌症,但都因为异常的发生不可控的细胞生长。根据美国癌症协会的研究,癌症是第二个在美国死亡的主要因素。如今,数以百万计的人或已经患有癌症1]。近年来,除了毒素,有许多不同的生物活性材料海洋动物提取等滋补、海绵、软珊瑚,海野兔,裸鳃,苔藓虫门、刮刀和其他海洋动物(2]。

涡轮coronatus月球也被称为国王头巾蜗牛在山姆已湾发现了1924年,但现在它是分散在-西太平洋,从东部和南部非洲到马来西亚,日本,从北到南,从南到印尼。它驻留潮汐区悬崖,以微小的海藻和植物为食。地壳的最大长度是5.5厘米。它生活在峭壁和卵石或潮汐缝(3]。福克纳说,研究人员分离7333自然海洋产品,包括藻类25%、海绵33%,腔肠动物如海鞭子和软珊瑚10%,剩下的24%是分开无脊椎动物如酸(也称为被囊类)、back-gills螺旋贝类像海兔的棘皮动物,如海星、海参和苔藓虫(4]。

Nabipour等人在评论报道,从611年在波斯湾类型的软体动物,其中172的分离和纯化生物活性化合物和抗癌物质和细胞毒性报道8种软体动物在波斯湾(5]。赞迪等人医学大学,布什尔,识别,提取,纯化紫色蛋白63 kDa分泌从海兔在波斯湾dactylomela抗癌的影响。纯化蛋白63 kDa的浓度等于0.5μg /毫升1.5μg /毫升阻止癌细胞的生长和扩散尤其是细胞株NB4 [6]。

材料和方法

样品收集

2公斤的软体动物涡轮coronatus收集来自潮汐地区12月的班达尔Lengeh位于地理坐标54°53 '东经(格林威治子午线)和26°33的北纬。样本运往软体动物研究中心的班达尔Lengeh容器的识别和确认其物种的海水。然后样本在海水水族馆举行活着直到提取时间。

的提取和制备分数

提取250 g的涡轮软组织从壳中提取(96%乙醇对预防感应身体的解析器从壳中提取酶后)被转移到2 L分隔符后压扁,被400毫升96%的乙醇提取的3天3重复。结果提取从分离器每次筋疲力尽,被旋转蒸发器干。1克干提取研究的细胞毒性效应。剩下的提取被固相法和氯仿,乙酸乙酯和甲醇溶剂分别到废液的颜色变成了苍白,TLC证实试验用于完成分数的准备。每个分数干下通风橱,远离光和保存在冰箱内(-18°C),直到细胞毒性效应的时间使用调查。

通过MTT法对细胞毒性的影响

细胞株的乳腺癌(T47D和MDA-MB468),正常动物(小鼠成纤维细胞,NIH / 3 t3)和人类正常(正常的乳腺上皮细胞,MCF 10 a)细胞库买来的巴斯德研究所的伊朗。所有使用autoclavable组件被高压蒸汽消毒前研究装置(120°C的温度和压力的20磅平方英寸)。培养介质rpmi - 1640用于培养细胞和最后的准备的培养基为7.2。媒介使用过滤装置,过滤消毒纸0.22微米内无菌厄伦美厄烧瓶和完整的灭菌条件下生物罩房间,冰箱里4°C。

缓冲PBS(磷酸缓冲盐)用作清洗溶剂之前trypsinzing细胞和使用Trypsin-EDTA稀释剂、青霉素、链霉素的混合物(Gibco-USA)是用于防止微生物污染的介质和5%的混合Trypsin-EDTA (Boehringer-Germany)用于分离细胞连接和螯合代理连接到钙和镁离子干扰胰岛素的行动。可以肯定的是没有污染的,媒介在孵化24小时后,确定没有污染,媒介在4°C冰箱。为培养和增殖的细胞,20%胎牛血清(的边后卫)被添加到这个媒介。血清是20分钟在5°C水浴使用灭活。(德国merck) MTT粉末制备5毫克/毫升的浓度(PBS)添加细胞培养基,并维持在-20°C。

执行细胞细胞毒性测试,104年每96孔细胞培养板和24小时在一个孵化器。然后,上层介质筋疲力尽,每个与PBS冲洗两次。200μl浓度不同的分数,以前在5 DMSO溶剂被添加到每个好,板培养24小时。22μl溶剂MTT (Dimethylthiazol-2-yl-2 5-diphenyltetrazolium溴)(Sigma-Germany) 5毫克/毫升的浓度添加到每个好,并孵化为4小时37°C孵化器。然后上每个好腾出的媒介,为解决fomazan晶体,100μl二甲亚砜DMSO溶液添加到每个,都放在孵化器3 - 4小时。然后,每个油井的光密度使用ELISA-reader读取450纳米波长的器官和细胞生存能力是使用以下公式计算百分比为每个浓度(7]。

细胞的生存能力= 100 X (OD样品)/ (OD控制)

计算致死率,上述结果是减去100和确定浓度水平导致的死亡一半的细胞(LC50),图表使用浓度和细胞死亡的水平。治疗期间执行的研究细胞24、48和72小时的浓度为0.1,1,10日,100年,1000年和10000微克每毫升氯仿和甲醇的酒精提取和分数,和浓度的0.07,0.7,7,70年、700年和7000年μg /毫升为乙酸乙酯部分进行。每个实验重复5次,结果报告为平均数±标准差。从这项研究中获得的数据受到单向方差分析(方差分析)。0.05概率水平的显著差异决心和差异治疗组测试数据的使用意义区别是使用单向数据均值方差分析和执行图基测试博士后。所有数据用SPSS软件进行统计分析和数据差异的显著性水平被认为是由α= 0.05。

确定目标提取和细胞系的特异性,动物(NIH / 3 t3)和人类(MCF10A)使用正常细胞;LC50值获得的提取和分数在乳腺癌细胞系(包括T47D和MDAMB468)划分LC50值和正常细胞的分数。如果由此产生的数量(LC50正常细胞/毒杀癌细胞线)超过3,它显示了一个相对具体行动来对抗癌症细胞系(8]。

结果

酒精提取的细胞毒性效应的结果,总结了分数的表1。根据统计计算,有显著的统计差异的结果数据在不同群体相同的治疗时间。同时,调查影响的差异提取和分数在不同的正常细胞系,统计检验表明,之间有显著差异的影响水平动物和人类类别。

样本	MTT试验
样本	MDA-MB468	T47D	NIH / 3 t3	MCF10A
氯仿萃取	36.84±11.78	19.77±9.97	10.00±2.36	0.4±0.03
甲醇分数	23.88±7.37	12.46±2.54	52.71±14.80	2.25±0.01
乙酸乙酯部分	12.04±1.61	28.23±5.60	26.96±8.90	2.31±0.03
提取	27.87±12.95	40.68±13.38	26.00±2.96	1.70±0.03

表1。提取的细胞毒性效应和不同的分数t . coronatus关于癌症和正常细胞系通过MTT法。数字代表LC₅₀值与μg /毫升。

讨论

一个重要的在寻找新的抗癌化合物主要影响细胞毒性效应是关注这些药物的副作用,这是获得的抗癌药物的特异性。关于大量海洋生物的细胞毒性的影响报道最近的几十年里,寻找发现新的化合物与大量的抗癌效果增加。调查认为效应的细胞毒性效应和比较它与其他类似的关于海洋软体动物的研究表明,研究物种对正常和肿瘤细胞具有强烈的细胞毒性作用(表2)。然而,目前的研究进行癌细胞和正常细胞,而不是两种类型。珀蒂等人进行的一项研究对细胞毒性的影响涡轮stenogyrus 1到4。这个实验进行不同的癌细胞和基于GI50从最大的细胞增殖抑制(50%浓度)对P388 (淋巴细胞性白血病细胞株)0.25μg /毫升。同时,GI50值获得研究的小等人乳腺癌细胞系(MCF7) 0.4μg /毫升(9]。

研究生物	研究了提取/分数	研究癌症或正常细胞系	报告的LC50(µg /毫升)
Anadara rhombea[10]	甲醇提取	加拿大皇家银行	60.9±1.8
牡蛎属edulk[11]	纯粹的提取	加拿大皇家银行	63.7±2.4
Arca granosa[12]	水提物	MCF-7	0.59±0.17
Mercenaria[13]	纯粹的提取	bgc - 823	0.16±0.003

表2。比较一些软体动物的细胞毒性效应研究在先前的研究不同的癌症和正常细胞。

统计比较研究了提取和分数的影响在两个类别的正常细胞显示这些数据之间存在显著差异。同时,通过调查的具体影响癌细胞比正常细胞与正常的人类细胞相比,没有提取或分数显示特定效应与癌症细胞系(LC50正常/ LC50癌症< 3)。比较甲醇比例的细胞毒性效应在正常动物NIH / 3 t3和正常人类线(MCF10A),报告对癌症的影响线在某些情况下是特别报道(LC50N / LC50C > 3)。因此,虽然许多研究世界各地执行使用NIH / 3 t3线为研究抗癌药物在体外培养基的特异性,似乎使用正常的人类细胞的特异性细胞毒性化合物的影响在一个更现实的形式。

根据调查的结果和方法的比较中执行之前的研究与当前的研究中,似乎这一研究中,调查的细胞毒性效应的海洋软体动物癌症细胞系也正常线路和调查的价值特异性指数在正常的人类比动物线,解释的价值和地位使用正常的人类而不是动物线除了指定软体动物细胞毒性的相当大的影响涡轮coronatus。

结论

细胞毒性影响96%的酒精提取和研究软体动物的分数涡轮coronatus在两行乳腺癌细胞已经相当大。然而,这种提取和分数的影响正常细胞系由显著差异还相当大,不仅仅是对肿瘤细胞株的影响。因此,只有包含具体指导有效的化合物可用分数癌症研究组织,现有有效化合物在这种软体动物可以更多的参加了在未来用于乳腺癌的治疗。

建议

更多更有效的净化分数癌症细胞系对癌症有更具体的影响线(特别是氯仿萃取)为了实现主要有效的化合物。

调查的目标分数的细胞毒性作用机制不同的方法(包括调查细胞凋亡感应或对细胞的影响基因组)。

引用

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