细胞毒性分析MTT测定孤立棉子酚的Bt和海拉细胞系Non-Bt棉花种子

文摘

本文处理孤立棉子酚的体外细胞毒性效应的研究从Bt和Non-Bt棉花种子在海拉细胞线。棉酚是一种多酚binaphthyl diadehyde自然黄颜色的颜料。不仅仅是棉花抗性物质植物自我防御系统可能对害虫和一些疾病也是一种重要的植物化学成分的化合物由于其巨大的利益几个生物学性质包括抗癌、抗艾滋病、抗氧化、抗菌和男性避孕。在这项研究中棉子酚表现出广谱抗癌活性的海拉细胞线。棉子酚的细胞毒性效应是摘要通过MTT (3 - (4 - 5-dimethylthiazolyl-2) 2、溴化5-dipheniltetrazolium)测定。棉子酚从Bt和Non-Bt棉花种子已经显示出剂量依赖性对海拉细胞系细胞毒性作用。棉子酚的体外筛选显示潜在的细胞毒性活动对海拉细胞线。死亡率11.5884%和22.6058%的3μg / 1μl孤立棉子酚的浓度从Bt和Non-Bt棉花种子提取物在海拉细胞株分别观察。因此,抑制浓度(IC50)被固定在50% 3μg / 1μl棉子酚的海拉细胞。标准的抗癌药物阿霉素(1毫克/毫升)也被用于这项研究证实抗癌活性棉子酚与Bt和Non-Bt棉花种子细胞生存能力的1.7828%。 The present study confirms the mild toxic effect of gossypol on HeLa cell lines and can preferably be used as anti-cancerous drug in combination with other natural similar compounds to replace the synthetic chemical drugs for fewer side effects.

关键字

棉子酚、海拉细胞MTTssay

介绍

Plantsre现代医学的基本知识的来源。lmostll植物的部分,即,树皮、根、stemnd seedsre已知不同的药用价值。使用天然产品的趋势increasednd thective植物extractsre经常筛选新药discoveriesnd ofntimicrobials面前。根据世界卫生组织(世卫组织)、药用植物是最好的来源获得各种各样的药物。波80%的个人药物化合物来自药用植物。因此,这些植物应该调查更好地理解它们的属性,safetynd效率。这项研究的植物选择棉花、最重要的纺织纤维cropnd是世界第二最重要的油料作物。棉花属于锦葵科,属Gossypiumnd包括50个不同物种,这些只有四个speciesre在印度栽培。

Gossypiumrboreumnd Gossypium harbaceum属于旧世界二倍体集团、新世界的地点四倍体栽培speciesre Gossypium hirsutumnd Gossypium barbdance。

Inndhra邦棉花种植inll三differentgro即气候地区,建邦者沿海地区,纳regionnd Rayalaseema地区。棉花种子remainsfter棉花轧是用于生产棉花籽油。植物被发现拥有一些人种药用的用途。棉花seedsnd叶子功能在传统医学各formsndre internallyndpplied外部治疗皮肤problemsnd受伤。头痛,喝掺了牛奶的是由棉花seedsnd粉。治疗痢疾islso内部注入seedsnd树叶。Spotsnd其他皮肤conditionsre治疗使用棉花种子或从树叶中提取。在西方医学,棉花是投入使用的形式调料,绷带,swabsnd药棉。科学调查表明,棉花rootsnd种子包含某些化合物,可能对健康有益,潜在治疗Cancernd艾滋病毒。在印度,宫颈癌是女性最常见的癌症,更常见的乳腺癌。 Every year, in India 132,000 new casesre diagnosednd 74,000 women die due to this cancer .Cervical Cancer is caused by the Human Papilloma virus (HPV).(Source: WHO/ICO Information Centre on Human Papilloma Virus (HPV)nd Cervical Cancer).

棉花含有棉子酚;多酚化合物是棉花植物的一部分自卫systemgainst昆虫pestsnd可能某些疾病(8]。Somemount棉子酚的反应往往与许多天然物质cottonseednd形式绑定棉子酚是无害的。然而,未反应的棉子酚的已知“自由棉子酚”是有毒的。因此自由棉子酚isnnti-nutritional factorndnti-cancergent限制cottonseednd其产品的使用(7]。棉子酚(2 2 n-bi (8-formyl-1 6 7 trihydroxy5-isopropyl-3-methyl萘)]是结晶化合物。棉子酚的分子式是C30H30O8。包合物形成的棉子酚studiedt不同的热力学条件。大多数的调查与棉子酚分子形成多个包合物。多态性,棉子酚包含化合物是dimorphismnd trimorphism。传统上,测定细胞生长是通过计算可行cellsfter与重要的染料染色。台盼蓝染色法是简单的方法来评估细胞膜完整性(thusssume细胞增殖或死亡),但该方法不是sensitivend不能bedapted高通量筛选。测量吸收放射性物质,通常出现胸苷,isccurate但islso time-consumingnd涉及放射性物质的处理。5-Dimethylthiazol-2-yl黄色MTT(3 -(4) 2, 5 -溴化diphenyltetrazolium,四唑)是减少到紫色甲瓒在活细胞的线粒体。

Thebsorbance measuringt这彩色的解决方案可以量化的特定波长分光光度计(通常是600到500海里)。Thebsorption马克斯依赖于所使用的溶剂。减少发生只有当线粒体还原酶enzymesrective, nd因此转换可以直接相关可行的(生活)细胞的数量。当登山的紫色甲瓒由细胞治疗withngent而产生的甲瓒登山未经处理的控制细胞的有效性thegent导致死亡的细胞可以推导出,通过生产的剂量反应曲线2]。MTT可溶性的解决方案组织培养媒体或平衡盐解决方案,无酚红、黄的颜色。线粒体脱氢酶四唑环的可行的细胞分裂,产生肝癌和紫色甲瓒晶体whichre不溶性inqueous解决方案。晶体可以溶解incidified异丙醇。由此产生的紫色的解决方案是spectrophotometrically测量。n增加细胞数量结果客栈的登山增加MTT甲瓒formedndn inbsorbance增加。MTT法的使用有局限性的影响:(1)cellsnd的生理状态(2)线粒体dehydrogenasectivity差异在不同的细胞类型。然而,细胞的MTT法测定是有用的在测量细胞生长分裂素,ntigenic刺激,增长factorsnd其他细胞生长促进试剂、细胞毒性研究,nd在细胞生长曲线的推导1- - - - - -20.]。

材料和方法

Isolationnd棉子酚的检测

提取棉酚三克Btnd Non-Bt棉花种子内核手动获取与乙醚提取crushednd (5 x 20毫升)10]。溶剂是evaporatedt低温tilln油性材料含有棉子酚。这是存储为进一步使用。棉子酚提取withqueouscetone用同样的方法。剩余leftfter自由棉子酚的提取withqueouscetone浸泡在2 m盐酸溶液(75毫升)10 minnd然后回流30 min.fter冷却,过滤解决方案。残留物洗withbsolute乙醇(15毫升)。

然后氯仿从extractt低温蒸发tilln油性材料含有棉子酚。具体棉子酚的化学测试进行检测样品种子提取物。为此5毫升的种子提取原油溶解在乙醇体积小的25 ml flasknd最终成交由马克比亚迪更多的乙醇。两毫升每样品溶液的试管separatelynd equalmount solidntimony氯wasd的每个测试tubend彻底混合。相似类型的测试执行与锡chloridend leadcetate。

cytotoxicctivity的评价:

细胞viabilitynd cytotoxicityssay被用于药物screeningnd细胞毒性测试的化学物质。海拉(人类cervixdeno癌)细胞系来自国立浦那。(海拉细胞是由Prof.Satyanarayana辛格协调员DBT-ISLARE,面板堆石坝Osmania大学海德拉巴)。

MTTssay是最好的已知的方法确定线粒体dehydrogenasectivity活细胞。在这种方法中,MTT降低NADH紫色甲瓒。然而,MTT甲瓒不溶于水,nd细胞形成紫色的针状晶体。因此测量thebsorbance之前,n需要有机溶剂来溶解晶体。dditionally, MTT甲瓒很难去除的细胞毒性细胞培养基从板井由于漂浮细胞MTT甲瓒针,给重要的井间误差(小巷,m1988年,etl)。海拉细胞被培养在RPMI 1640中10%的边后卫,青霉素100单位/毫升、nd 100毫克/毫升链霉素。海拉细胞被子culturednd maintainedt 370行ct二氧化碳5%二氧化碳培养箱。文化是每24小时连续监控。观察undern倒置显微镜把confluencynd程度确认thebsence ofny微生物污染物。体外细胞毒性效应的研究Btnd Non-Bt棉花种子孤立棉子酚wasssessed通过MTT (3 - (4 5-dimethylthiazolyl-2) 2、溴化5-diphenyltetrazolium) ssay。 Cell lines were sub culturednd 250μl of media (containing 10000cells) were transferred into 96 well platesnd incubated for 24 hr. The cells were subcultured with 100μl of fresh medium. Isolated Gossypol wasddedt different concentration (1-3μg/μl)nd then final volume was made to 200μl with the mediand incubated for 4 hr.fter incubation media containing drug was removed. 20μl of MTT reagent (6mg/ml in PBS) wasdded to each well containing mediand incubated for 3 hrt 37 °C underntmosphere of 5% CO2 until purple precipitate was observed. Media was removed without disturbing cellsnd 200μl DMSO (MTT solvent) wasdded to dissolve the purple precipitate.bsorbance was readt 570 nm with reference filter of 630 nm. Percentage cytotoxicity was calculatednd used for finding the IC50 value of the concentration required for 50% cell death by Gossypol, isolated from Btnd Non-Bt cotton seed.

结果和对比

棉子酚的检测的样本Btnd Non-Bt棉籽提取三个具体化学构象与SbCl3测试,Pb (CH3COO) 2日SnCl3进行。浑浊的红色complexppeared SbCl3fter 15分钟。而红色与四氯化锡precipitateppearedfter 10分钟。测试leadcetate给黄色沉淀thatppearedfter 20分钟确认存在棉子酚的样本。在这项研究中,我们使用剂量dependentpproach评估孤立棉子酚的毒性来自Btnd non-Bt棉花种子在海拉细胞线不同浓度(1μg / 1μl 3μg / 1μl)。

细胞毒性观察结果显示,有意义和剂量依赖的浓度Btnd non-Bt棉花种子孤立棉子酚1μg / 1μl 2μg / 1μlnd 3μg / 1μl分别在海拉细胞系(表1和图1)。阿霉素用于standardnti癌症药物。从结果证实,DMSO对海拉cellsnd没有影响对棉子酚用于溶解溶剂。t 1μg / 1μl viabilitynd non-Btnd Bt棉酚剂量的细胞毒性的海拉细胞比例为81.21%,分别为93.37%、18.78%和3.87%。Similarlyt 2μg / 1μl viabilitynd Non-Btnd Bt棉酚剂量的细胞毒性的海拉细胞比例是95.57%,分别为93.37%、19.6%和9.58%。t 3μg / 1μl viabilitynd Non-Btnd Bt棉酚剂量的细胞毒性的海拉细胞比例是97.2%,92.5%,22.6%和11.5%。根据我们之前报道的水平棉子酚更在相应non-Bt棉花种子细胞毒性被发现更多与3μg non-Bt棉花种子孤立棉子酚/ 1μl剂量浓度的依赖。

Cytoxicityctivity棉子酚的人类乳腺癌细胞被杰西w报道。Jarsozewski etll;(1990)、棉子酚抑制人类Headnd growthndpoptosis颈部鳞状细胞癌体内报道了基思·g·沃尔特etl (9]。增加百分比ofpoptotic观察细胞在肿瘤治疗和控制棉子酚inducedpoptosis在卵巢癌细胞氧化应激为Romano etl (8]。相比tobove三个引用,在这个孤立的studylsonticancerousctivity Btnd非Bt棉酚显示轻度希拉癌症细胞系细胞毒性。棉子酚的体外筛选显示潜在cytotoxicctivitygainst希拉癌细胞linesnd死亡率为11.5884 22.6058%在3μg / 1μl从Btnd非Bt分别分离出棉子酚的浓度。因此,抑制concentrationt 50% (IC50) fixedt 3μg / 1μl (Graphnd表2)棉子酚的海拉细胞(21- - - - - -37]。

结论

Presentnalysis透露moremount Non-Bt棉子酚的棉花种子。棉子酚天然化合物显示出更多比例的细胞生存能力相比standardnti-cancer药物阿霉素。细胞毒性为可行的细胞最大non-Bt棉花种子棉子酚指示海拉细胞的有效控制时间。目前的研究证实棉子酚的毒性作用温和的海拉细胞linesnd最好可以usedsnti-cancerous药物结合其他自然相似化合物取代合成化学药物的副作用更小。

Acknowdgement

•uthorsre highlycknowledged UGC政府。印度(RFSMS-FELLOWSHIP)资助这个项目。

•uthors表达衷心感谢Y。首席科学家(植物育种),罗摩Reddy REGIONALGRICULRAL研究站,NANDYAL, Kurnul Dist.518503, ndhra邦,印度为及时提供种子材料。

•uthorsre highlycknowledged Researchnd发展中心设施(9)Osmania大学,海德拉巴,支持的仪器来完成这项工作。

•uthors表达他们的衷心感谢。Kishorend Jalapathi。Pochampalli(助理教授)化学系,科学大学Saifabad, Osmania大学海德拉巴,ndhra邦,印度——5000004。

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