研究与评论:药理学与毒雷竞技苹果下载理学研究杂志
菜单e-ISSN: 2322-0139 p-ISSN: 2322-0120
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1印度恩得拉邦海得拉巴的奥斯马尼亚大学Saifabad理学院植物系
收到日期:28/07/2014;修订日期:09/08/2014;接受日期:19/08/2014
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本文研究了从Bt和非Bt棉籽中分离得到的棉酚对HeLa细胞的体外细胞毒作用。棉酚是一种多酚双酚二醛天然黄色色素。它不仅是棉花植物对害虫和可能的一些疾病的自我防御系统的抵抗物质，而且由于其具有抗癌、抗hiv、抗氧化、抗菌和男性避孕等多种生物学特性而成为一种重要的植物化合物。在本研究中，棉酚对HeLa细胞系表现出广谱的抗癌活性。采用MTT(3-(4-，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯四唑溴化物法测定棉酚的细胞毒性作用。从Bt和非Bt棉籽中提取的棉酚对HeLa细胞具有剂量依赖性的细胞毒性作用。体外筛选的棉酚显示出潜在的细胞毒活性对HeLa细胞系。3μg/1μl浓度的Bt和非Bt棉籽提取物棉酚对HeLa细胞株的死亡率分别为11.5884%和22.6058%。因此，50%的抑制浓度(IC50)固定在3μg/1μl棉酚。本研究还使用标准抗癌药物阿霉素(1mg/ml)，从Bt和非Bt棉籽中分离得到棉酚，细胞活力为1.7828%。 The present study confirms the mild toxic effect of gossypol on HeLa cell lines and can preferably be used as anti-cancerous drug in combination with other natural similar compounds to replace the synthetic chemical drugs for fewer side effects.
棉酚，海拉细胞，MTTssay
植物是现代医学知识的基本来源。植物的大部分部分，即树皮、根、茎和种子都具有不同的药用特性。使用天然产品的趋势有所增加，经常筛选用于新药发现的植物提取物中存在的微生物。根据世界卫生组织(WHO)的说法，药用植物将是获得各种药物的最佳来源。大约80%的单一药物含有从药用植物中提取的化合物。因此，应该对这些植物进行研究，以更好地了解它们的性质、安全性和效率。本研究选择的植物是棉花，它是世界上最重要的纺织纤维作物，也是世界上第二大油料作物。棉花属于锦葵科，棉属包括50个不同的品种，其中只有4个品种在印度种植。
古棉属旧世界二倍体类群，其中新世界四倍体栽培种为毛棉和蛮棉。
印德拉邦的棉花种植在三个不同的气候区，即沿海地区，泰伦加纳地区和Rayalaseema地区。经过棉皮处理后的棉籽用于生产棉籽油。这种植物已被发现具有几种民族药用价值。棉籽和棉叶在传统医学中有各种形式，内服外敷，治疗皮肤问题和损伤。对于头痛，饮料是用棉籽粉和牛奶混合而成的。用种子和叶子冲剂治疗痢疾。用棉籽或棉叶提取物治疗斑点和其他皮肤状况。在西医中，棉花以敷料、绷带、棉絮的形式使用。科学调查表明，棉根种子含有某些可能对健康有益的化合物，可能用于治疗癌症艾滋病毒。在印度，宫颈癌是女性最常见的癌症，甚至比乳腺癌更常见。 Every year, in India 132,000 new casesre diagnosednd 74,000 women die due to this cancer .Cervical Cancer is caused by the Human Papilloma virus (HPV).(Source: WHO/ICO Information Centre on Human Papilloma Virus (HPV)nd Cervical Cancer).
棉花含有棉酚;一种多酚化合物，是棉花植物防御害虫和某些疾病系统的组成部分[8]。一定量的棉酚会与棉籽中的许多天然物质发生反应，形成无害化的结合棉酚。然而，未反应的棉酚被称为“游离棉酚”是有毒的。因此游离棉酚既不是营养因素，也不是限制棉籽及其产品使用的致癌物质[7]。棉酚[2,2n - bi(8-甲酰- 1,6,7，三羟基5-异丙基-3-甲基萘)]是结晶化合物。棉酚的分子式为C30H30O8。研究了棉酚在不同热力学条件下形成包合物的过程。所研究的分子大多与棉酚形成一种以上的包合物。棉酚包合物的多态性表现为二态和三态。传统上，细胞生长的测定是用活性染料染色后计数活细胞来完成的。台盼蓝染色是评价细胞膜完整性(进而判断细胞增殖或死亡)的简单方法，但灵敏度不高，不宜用于高通量筛选。测量放射性物质(通常是氚标记的胸苷)的摄取很容易，但涉及到放射性物质的处理，耗时很长。黄色MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑，四氮唑)在活细胞的线粒体中被还原为紫色的甲马赞。
这种有色溶液的吸光度可以通过分光光度计测量一定波长(通常在500到600 nm之间)来定量。最大吸收率取决于所使用的溶剂。减少发生只有当线粒体还原酶enzymesrective, nd因此转换可以直接相关可行的(生活)细胞的数量。当用该药剂处理的细胞产生的紫色甲马甲的量与未处理的对照细胞产生的甲马甲的量进行比较时，通过产生剂量-反应曲线，可以推断该药剂引起细胞死亡的效果[2]。MTT溶液溶于组织培养基或平衡盐溶液，无酚红，颜色淡黄色。活细胞的线粒体脱氢酶裂解四唑环，产生紫色MTT甲醛晶体，这是不溶的溶液。该晶体可溶于掺入的异丙醇。所得的紫色溶液用分光光度法测量。细胞数量的增加导致MTT含量的增加和吸附性的增加。MTT法的使用有局限性的影响:(1)cellsnd的生理状态(2)线粒体dehydrogenasectivity差异在不同的细胞类型。然而，细胞测定的MTT方法在测量细胞对有丝分裂原、原性刺激、生长因子和其他细胞生长促进试剂的反应、细胞毒性研究以及推导细胞生长曲线时是有用的[1-20.]。
棉酚的分离检测
为了提取棉酚，将手工获得的3克Btnd非bt棉籽核压碎，用乙醚提取(5 x 20 ml) [10]。将溶剂低温蒸发，得到含棉酚的油性物质。它被存储起来以备将来使用。用同样的方法，用喹烯酮提取棉酚。用喹烯酮提取游离棉酚后的残液在2M HCl溶液(75 ml)中浸泡10分钟，回流30分钟，冷却后过滤。用无水乙醇(15ml)清洗残渣。
然后从提取液中低温蒸发氯仿，得到含棉酚的油状物质。对种子提取物样品中的棉酚进行了特异性化学检测。为此目的，将5毫升种子提取物粗品溶解在25毫升的锥形烧瓶中，加入少量乙醇，使最终体积达到标记。分别在试管中取各样品溶液2毫升，在每个试管中加入等量的氯化固体，充分混合。对氯化锡酸铅也进行了类似类型的试验。
细胞毒性评价:
细胞活力和细胞毒性测定用于药物筛选和化学药品的细胞毒性试验。HeLa(人宫颈癌)细胞系来自NCCS Pune。(HeLa细胞由satyanarayana Singh教授提供，DBT-ISLARE, CFRD Osmania大学，海德拉巴)。
MTTssay是最著名的测定活细胞中线粒体脱氢性的方法。在此方法中，MTT被NADH还原为紫甲甲聚糖。然而，MTT甲醛不溶于水，在细胞内形成紫色针状晶体。因此，在测量吸光度之前，需要n个有机溶剂来溶解晶体。此外，MTT福马森的细胞毒性使细胞培养基难以从平板孔中移除，因为MTT福马森针会使细胞漂浮，造成显著的孔间误差(Alley,M.C.1988年,etl)。HeLa细胞培养于RPMI 1640培养基中，含10%胎牛血清、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素。HeLa细胞株在CO2培养箱中370Ct 5% CO2传代培养。每24小时连续监测培养。倒置显微镜下观察，观察其合流程度，以确定有无微生物污染物。采用MTT法(3-(4,5 -二甲基噻唑-2)- 2,5 -二苯四唑溴化铵)对Btnd非bt棉籽分离棉酚的体外细胞毒作用进行了研究。 Cell lines were sub culturednd 250μl of media (containing 10000cells) were transferred into 96 well platesnd incubated for 24 hr. The cells were subcultured with 100μl of fresh medium. Isolated Gossypol wasddedt different concentration (1-3μg/μl)nd then final volume was made to 200μl with the mediand incubated for 4 hr.fter incubation media containing drug was removed. 20μl of MTT reagent (6mg/ml in PBS) wasdded to each well containing mediand incubated for 3 hrt 37 °C underntmosphere of 5% CO2 until purple precipitate was observed. Media was removed without disturbing cellsnd 200μl DMSO (MTT solvent) wasdded to dissolve the purple precipitate.bsorbance was readt 570 nm with reference filter of 630 nm. Percentage cytotoxicity was calculatednd used for finding the IC50 value of the concentration required for 50% cell death by Gossypol, isolated from Btnd Non-Bt cotton seed.
用SbCl3、Pb(CH3COO) 2sncl3进行了三种特殊化学构象试验，以检测Btnd非bt棉籽提取物样品中的棉酚。浑浊的红色complexppeared SbCl3fter 15分钟。而红色与四氯化锡precipitateppearedfter 10分钟。用铅酸盐测试得到淡黄色的沉淀物，20分钟后出现，证实样品中存在棉酚。在这项研究中,我们使用剂量dependentpproach评估孤立棉子酚的毒性来自Btnd non-Bt棉花种子在海拉细胞线不同浓度(1μg / 1μl 3μg / 1μl)。
结果表明，Btnd非bt棉籽分离棉酚的剂量依赖浓度分别为1μg/1μl、2μg/1μl和3μg/1μl，对HeLa细胞有显著的细胞毒作用(表1而且图1)．阿霉素是一种标准的抗癌药物。结果证实DMSO对HeLa细胞无影响，d是棉酚的溶解溶剂。t 1μg/1μl非btnd Bt棉酚剂量对HeLa细胞系的细胞毒性百分率分别为81.21%、93.37%、18.78%和3.87%。同样，2μg/1μl Non-Btnd Bt棉酚对HeLa细胞系的细胞毒性百分率分别为95.57%、93.37%、19.6%和9.58%。3μg/1μl Non-Btnd Bt棉酚剂量对HeLa细胞株的细胞毒性分别为97.2%、92.5%、22.6%和11.5%。根据我们之前的报道，非bt棉籽中棉酚的含量较高，相应的，3μg/1μl分离棉酚对非bt棉籽的细胞毒性更强。
表1:对HeLa癌细胞系的细胞毒活性
图1:对HeLa癌细胞系的细胞毒活性图解
棉酚对人乳腺癌细胞的细胞毒性由Jerzy w.Jarsozewski等人报道;(1990)棉酚抑制人头颈部鳞状细胞癌的生长凋亡由Keith G. wolter等人报道[9]。经治疗的肿瘤与对照组相比，观察到棉酚诱导的卵巢癌细胞凋亡百分比增加。Romano etl [8]。与上述三种文献相比，本研究中从Btnd非Bt中分离出的棉酚的超声致癌活性对HeLa癌细胞株显示出轻度的细胞毒性。体外筛选的棉酚对HeLa癌细胞有潜在的细胞毒作用，3μg/1μl分离的Btnd非Bt棉酚的死亡率分别为11.5884和22.6058%。因此，抑制浓度50% (IC50)固定在3μg/1μl (Graphnd表2)对海拉细胞的作用[21-37]。
表2:50%时的抑制浓度(IC50)固定为(图和表)
图2
目前分析表明，非bt棉籽中棉酚含量较高。与标准抗癌药物阿霉素相比，棉酚天然化合物显示出更高的细胞活力百分比。非bt棉籽棉酚对活细胞的细胞毒性最大，表明在一段时间内有效控制HeLa细胞。本研究证实棉酚对HeLa细胞株毒性较轻，可与其他天然同类化合物联合使用，替代人工合成的化学药物，副作用小。
•作者高度赞扬印度教育资助委员会政府(RFSMS-FELLOWSHIP)资助该项目。
•作者真诚地感谢印度恩得拉邦(ndhra Pradesh)库尔努尔区(Kurnul dist518503)南亚尔(nanyal)区域农业研究站首席科学家(植物育种)Y.Rama Reddy及时提供种子材料。
•作者高度赞扬中央研究开发设施(CFRD)奥斯马尼亚大学，海得拉巴，为完成这项工作提供仪器支持。
作者表示衷心感谢。Kishorend Jalapathi。Pochampalli(助理教授)化学系，大学理学院，Saifabad, Osmania大学海得拉巴，ndhra Pradesh，印度5000004。
