基于新创转录组测序鉴定Amb存在花粉过敏原共同点豚草(虫道artemisiifolia)

文摘

完整的编码序列和公认的信号肽Amb 3同种型被确认的a . artemisiifolia的转录组数据集。与已知的蛋白质序列Amb 3过敏原和硅片变应原性分析。因为Amb 3知只是一种氨基酸序列,给出结果有助于探索遗传变异性和Amb 3的表现特征,以及可能导致免疫研究花粉过敏原。

关键字

豚草,特别美味的食物过敏原、Amb 3、转录组。

介绍

普通豚草(特别美味的食物artemisiifolial .),原产于北美是上个世纪最成功的入侵植物物种(1]。在欧洲的一些地区,特别是在喀尔巴阡盆地是最广泛的杂草[2]。豚草花粉是高度过敏和越来越多的病人患有豚草花粉病(季节性过敏性鼻炎)在开花季节,持续从7月中旬到9月底。在北美东部花粉占41%的年度花粉捕捉(3]。工厂生产平均约八十亿花粉粒和机载花粉危及健康甚至在遥远的地区2,4]。考虑其重要性的全面知识的过敏原的花粉是准确的诊断和有效的免疫疗法的先决条件(5]。

常见的过敏原豚草很小,不到40 kDa分子量简单蛋白质。世卫组织/ iui过敏原命名数据库分类10种答:artemisiifolia过敏原(6]。Amb 1和Amb 11分别视为主要的过敏原,而其他人则根据他们的重要性较小的蛋白质和敏感这些计数小调过敏原(7,8]。然而,对于几乎所有Amb过敏原和亚型核酸和蛋白质序列是已知的,质体蓝素Amb 3是已知的氨基酸序列(9]。最近发展的高通量分析技术支持大型数据集的生成,促进基因的识别和同源序列。在这项研究中基于新创转录组测序分析和假定的编码序列的Amb存在蛋白质已被确认。

材料和方法

植物材料

总共六个豚草植物在自然条件下边缘的耕地(Keszthely、匈牙利)使用。年轻芽前花分化满是透明纸袋子,以保护他们免受空气污染。RNA提取雄花在七个不同的发展阶段抽样从原始阶段到成熟开放复合花花,能够识别尽可能多的基因表达在花发育。

分子实验

RNA提取RNAzol(美国Sigma-Aldrich)根据制造商的建议。基于多聚腺苷酸mRNA浓缩和互补脱氧核糖核酸合成Illumina公司TruSeqTM RNA样品制备设备(低吞吐量协议)是根据制造商的指示。使用Illumina公司执行RNA-Seq HiSeq2000(美国Illumina公司)系统。每个片段pair-end测序100核苷酸深。

新创组装和高通量测序数据的分析

新创的转录组进行使用short-reads汇编程序,三一(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/BETA/)结合重叠长100 bp读取从每个样本形成重叠群。聚集转录组Trinotate注释的注释适合使用(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/annotation/Trinotate。html)。

调查的具体编码序列的基因被确定使用爆炸®命令行应用程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279670/)。蛋白质序列的研究过敏原从Uniprot数据库下载。tBLASTn对齐后组装使用蛋白质转录组作为一个数据库查询这些序列,最好2 - 3支安打(价值截止1.0 e-5)进行了分析。对齐的最佳得分显示重叠群和决心的ORF编码序列的测定Geneious®软件。

注释

使用UniProt爆炸序列做了注释,对齐和注释的功能。

信号肽的分析

信号肽识别signalp - 4.1程序使用(10]。

分析序列变异

氨基酸插入/删除和替换的影响生物功能的蛋白质与PROVEAN分析软件(http://provean.jcvi.org/j·克雷格·文特尔研究所的)。(11]

变应原性预测

以下软件应用:

AlgPred-the支持向量机(SVM),基于主题的MEME /桅杆,段过敏原代表蛋白质(ARPs)和段与已知的IgE抗原决定基函数(已使用12]。

AllergenFP v.1.0-for鉴定的蛋白质根据Tanimoto相似性系数最高的。AllerTOP v.2.0-for确定最近的蛋白质(13,14]。

预测的大

AllerHunter (http://tiger.dbs.nus.edu.sg/AllerHunter/index.html)软件是用来预测与其他过敏原的交叉反应性。

结果

从转录组数据集TR2040叠连群显示90%的序列相似性在97%覆盖率的已知长101氨基酸序列Amb 3过敏原(图1),支持2 e-55创造价值。长107 aa, 12.02 kDA TR2040编码序列的蛋白质分子量翻译之前24长期公认的信号肽,氨基酸,继续在一个氨基端地区与Amb 3蛋白质相同。相比Amb 3,删除,插入和七个六个氨基酸替换被发现的c端一端TR2040蛋白质。其他两个序列的重叠部分是相同的。由于这种结构相似,认为确定TR2040蛋白是Amb的同种型3,因此,从今以后我们将它称为Amb存在。

Amb的长396核苷酸编码序列存在序列被确定在NCBI读取存档(SRA)。豚草花粉转录组ERR231631 LS454平台上和ERR231632测序。众多读入这些运行发现有相同的氨基酸序列Amb存在,支持,装配是正确的在我们的实验中14]。

氨基酸的影响删除、插入和替换相比Amb 3 PROVEAN蛋白质分析的程序(11]。除了G100P替换,有害的影响预测,W53删除,以及插入(86 f87和90 fdhcqr91)和所有替换(R54K、D91G C97N, P99T和R101S)被评为中性影响蛋白质的功能。

Amb 3序列注释显示在61年和88年氨基酸二硫键位置,这意味着一个信号肽(见上图),和41和84个氨基酸,糖基化和半胱氨酸- 97巯基被修改,但是并没有形成一个跨链二硫键。除了C97N替换这些头寸相同的Amb的氨基酸存在蛋白质,假设相同的功能。

AlgPred过敏性预测分析的软件没有检测实验证明IgE抗原决定基在Amb 3和同种型。然而,支持向量机分析基于氨基酸以及二肽成分预测同种型是一个潜在的过敏原。预测的变应原性的支持也为数据库中。AllergenFP分析显示,最高的蛋白质Tanimoto相似性指数(0.88)Amb Amb 3存在,而这同种型是一个可能的过敏原。大AllerHunter分析软件预测没有大的两种蛋白质与已知的过敏原。

在NCBI守恒的域分析表明,蛋白质(Amb 3和Amb存在)属于cupredoxin总科。假定的Cu-bind-like (plastocyanin-like)域和phytocyanin域在同一位置开始在这两种蛋白质,但在Amb存在这些花费了更长的时间比Amb 3 (c端端表1)。这些假定的域的Amb 3结束变量地区相比Amb存在正开始。进一步,在Amb存在非特异性blue-copper-like蛋白质域覆盖除了最后一个完整的c端氨基酸最终也获得了(表1)。

表1。守恒的域分析的总结。

讨论

完整的编码序列的Amb 3同种型被确认的转录组数据集答:artemisiifolia。编码序列被发现396核苷酸长,根据氨基酸组成代码12 kDa分子量的蛋白质。这是更大,比11 kDa Amb注册一个3人/ iui过敏原命名数据库,分子量由sds - page。然而,Amb存在是有六个氨基酸超过Amb 3,对装配支持SRA研究LS454平台上执行(6]。许多454读取识别高(> 98%)序列相似性Amb存在,对于他们中的许多人翻译序列一致,Amb存在(6]。Klapper等人得出的结论是,有证据表明花粉收集在不同的地理区域显示Ra3中(Amb 3)氨基酸序列变异9]。因此,我们认为Amb Amb的存在是一个同种型3花粉过敏原。

在硅片变应原性与可用的软件进行分析,需要实验结果确认。

IgE Amb 3的反应被发现在不同的实验研究[15- - - - - -18]。Bordas-Floch等人发现Amb 3 18%的花粉过敏患者的过敏原,这号码是高于其他已知的小短豚草过敏原,如Amb 4, 5, 6, 9和105]。然而,实验证明IgE抗原表位的Amb 3尚未确定,Atassi和Atassi确定地区相当大的IgE Amb绑定能力3。使用15氨基酸长重叠合成Amb三肽定量immunoadsorbent滴定的方法,他们得出结论,保护主义,21-35,31 - 45岁,51 - 65和71 - 85 Amb 3 aa地区相当大(5.3 -30.8%)IgE绑定能力(16]。这些地区除了W53删除和R54 K替换Amb 3和Amb 3之间是相同的。W53和R54 K Provean蛋白项目评估的中性影响蛋白质的功能。因此,可以认为,这两种蛋白可能有相同的IgE抗原表位。

有趣的是,尽管最近的研究未能发现Amb 3过敏原在转录组和蛋白质组分析,他们发现了一个高度相似的分子,以96.7%的氨基末端部分氨基酸序列的身份,但用不同的c端结束。这些研究结果与我们的结果一致,表明Amb 3亚型的存在在豚草allergome [5,15]。

Amb 3被认为是一个质体蓝素,真的,守恒的域分析了具体击中plastocyanin-like域而非特异性phytocyanin域。质体蓝素铜蛋白质参与电子传递。Phytocyanins也参与了电子转移反应和归类为植物蓝色或I型铜的蛋白质。Amb存在守恒的域分析表明具体击中phytocyanin plastocyanin-like域和非特异性,因此认为Amb存在属于植物蓝铜蛋白。这个建议得到这样的非特异性达到临时蓝铜蛋白Amb存在。

对于Amb 3没有出版的核苷酸序列。转录组Amb的存在是最类似于Amb 3蛋白质。研究Amb的功能存在克隆和表达分析在不同发展阶段的男性花是在进步。然后,重组蛋白可以进行蛋白质组学和免疫学研究和生产这些结果可以与Amb 3。因此,我们希望确定核苷酸序列将在进一步有用植物基因组和免疫学研究Amb 3和同源基因。

确认

本研究由K100919 OTKA匈牙利科学院的项目。

引用

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