豚草花粉变应原Amb a的转录组测序分析

摘要

从青蒿转录组数据集中鉴定了Amb a3亚型的完整编码序列和推测的信号肽。与已知的amba3变应原蛋白序列和硅致敏分析进行了比较。由于Amb a3仅通过氨基酸序列已知，本研究结果有助于探索Amb a3的遗传变异和表达特征，并为该花粉过敏原的免疫学研究提供参考。

关键字

豚草，豚草，过敏原，amba3，转录组。

介绍

豚草(特别美味的食物artemisiifoliaL.)，原产于北美，是上世纪最成功的入侵植物物种之一[1]。在欧洲的一些地区，尤其是喀尔巴阡盆地，它是分布最广的杂草。2]。豚草花粉具有高度致敏性，在7月中旬至9月底的开花季节，越来越多的患者患有Ambrosia pollinosis(季节性变应性鼻炎)。在北美东部，豚草花粉占全年花粉捕获量的41% [3.]。一株植物平均产生约80亿粒花粉，空气中的花粉即使在遥远的地区也会危害健康[2，4]。考虑到豚草花粉过敏原的重要性，全面了解豚草花粉过敏原库是准确诊断和有效免疫治疗的先决条件[5]。

豚草的过敏原很小，分子量小于40kda的简单蛋白质。WHO/IUIS过敏原命名数据库将过敏原分类为10种答:artemisiifolia过敏原(6]。amba1和amba11分别被认为是主要过敏原，而其他是较小的蛋白质，根据它们在致敏作用中的重要性，它们被视为次要过敏原[7，8]。然而，对于几乎所有的Amb a过敏原和异构体(包括核酸和蛋白质序列)，都是已知的，而血浆色素Amb a 3仅通过氨基酸序列已知[9]。近年来高通量分析技术的发展使大数据集的生成成为可能，促进了基因和同源序列的识别。在这项研究中，进行了基于从头转录组测序的分析，并确定了一种Amb (3-like protein)的假定编码序列。

材料与方法

植物材料

总共有6株豚草植物生长在一片耕地边缘的自然条件下(匈牙利Keszthely)。花分化前用透明纸袋包裹嫩枝，防止空气污染。RNA提取从复合花的原始期到成熟开花期的7个不同发育阶段对雄花进行采样，以尽可能多地鉴定花发育过程中表达的基因。

分子实验

RNA由RNAzol (Sigma-Aldrich, USA)根据生产商的建议进行提取。对于基于poly-A的mRNA富集和cDNA合成，根据制造商的说明使用Illumina TruSeqTM RNA样品制备试剂盒(低通量协议)。RNA-Seq使用Illumina HiSeq2000 (Illumina, USA)系统进行。每个片段对端测序100个核苷酸深。

高通量测序数据的从头组装和分析

转录组从头组装使用short-reads组装程序Trinity (http://trinityrnaseq.sourceforge.net/BETA/)，将每个样本中重叠的100 bp长reads组合成contigs。对于组装转录组的注释，使用了Trinotate注释套装(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/annotation/Trinotate。超文本标记语言)。

使用BLAST®命令行应用程序识别所调查基因的确切编码序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279670/)。从Uniprot数据库中下载被测过敏原的蛋白序列。利用这些序列的蛋白质查询，将组装好的转录组作为数据库进行tBLASTn比对后，分析最佳的2-3个命中(e值截断值为1.0E-5)。显示contigs的最佳分数对齐和编码序列ORF的确定由genous®软件确定。

注释

序列注释使用UniProt Blast、对齐和注释函数完成。

信号肽分析

信号肽鉴定使用SignalP-4.1程序[10]。

序列变异分析

利用PROVEAN protein软件(http://provean.jcvi.org/)。［11］

变应原性预测

应用以下软件:

algpred -支持向量机(SVM)，基于motif的MEME/MAST，过敏原代表蛋白(ARPs)片段和与已知IgE表位功能相同的片段已被使用[12]。

AllergenFP v.1.0-用于基于谷本系数的相似性最高的蛋白质的鉴定。AllerTOP v.2.0-用于测定最近的蛋白质[13，14]。

交叉反应性预测

过敏症猎人(http://tiger.dbs.nus.edu.sg/AllerHunter/index.html)软件用于预测与其他过敏原的交叉反应。

结果

从转录组数据集来看，TR2040 contig与Amb a 3过敏原已知的101个氨基酸长序列在97%的序列覆盖率下显示出90%的相似性(图1)，由2e-55 E-value支持。TR2040编码序列的翻译蛋白长107 aa，分子量12.02 kDA，其前面是一个长24个氨基酸的推测信号肽，其n端区域与Amb a 3蛋白相同。与Amb a3相比，TR2040蛋白c端有1个缺失，7个插入和6个氨基酸取代。两个序列的其他重叠部分是相同的。由于结构上的相似性，我们认为鉴定出的TR2040蛋白是Amb a 3的一种亚型，因此下文简称为Amb a 3-like。

在NCBI序列阅读档案(sequence Read Archive, SRA)中也鉴定了Amb a 3-like的396个核苷酸长编码序列。在LS454平台上对仙草花粉转录组ERR231631和ERR231632进行测序。在这些序列中发现了大量与Amb a 3-like氨基酸序列相同的reads，支持了我们实验中的组装是正确的[14]。

通过PROVEAN蛋白程序分析Amb a3与Amb a3相比氨基酸缺失、插入和替换的影响[11]。除了G100P取代被预测会产生有害影响外，W53缺失、插入(86F87和90FDHCQR91)和所有取代(R54K、D91G、C97N、P99T和R101S)被评估为对该蛋白功能具有中性影响。

Amb a3的序列注释表明，在61和88个氨基酸位置有一个二硫键，这意味着一个信号肽(见上文)，在41和84个氨基酸位置有糖基化，还有一个Cys-97巯基被修饰，但不形成链间二硫键。除了C97N取代外，Amb a 3-like蛋白在这些位置上的氨基酸也是相同的，假设它们的功能相同。

AlgPred软件的致敏性预测分析在Amb a3和亚型中均未检测到经实验证实的IgE表位。然而，基于氨基酸和二肽组成的SVM分析预测该亚型是潜在的过敏原。ARPs数据库中的命中数也支持预测的致敏性。AllergenFP分析显示，与amba3样蛋白Tanimoto相似指数(0.88)最高的蛋白为amba3样蛋白，该异构体为可能的过敏原。通过AllerHunter软件进行交叉反应分析，预测两种蛋白与已知过敏原无交叉反应。

NCBI保守结构域分析表明，Amb a 3和Amb a 3-like均属于铜还蛋白超家族。在这两个蛋白中，假定的cu - binding -like (plasocyanin -like)结构域和phytocyanin结构域开始于相同的位置，但在Amb a 3-like中，这些结构域在c端比Amb a 3中更长(表1)。amba3的假定定义域在与amba3类比较的可变区域开始时结束。此外，在Amb中，除了最后一个氨基酸外，还获得了一个覆盖在蓝铜样蛋白结构域上的3-like非特异性命中，也获得了完整的c端(表1)。

表1。保守域分析总结。

讨论

Amb a3亚型的完整编码序列是从一种Amb a3亚型的转录组数据集中鉴定的答:artemisiifolia。该编码序列长396个核苷酸，按氨基酸组成编码一个分子量为12 kDa的蛋白质。这比WHO/IUIS过敏原命名数据库中登记的11 kDa Amb a 3要大一些，后者的分子量是通过SDS-PAGE测定的。而Amb a 3-like比Amb a 3长6个氨基酸，在LS454平台上进行的SRA研究支持正确的组装[6]。454个reads被鉴定为与Amb A 3-like序列高度相似(>98%)，其中许多翻译序列与Amb A 3-like相同[6]。Klapper等人认为，有证据表明在不同地理区域采集的花粉存在Ra3 (Amb a3)氨基酸序列差异[9]。因此，我们认为amba3样过敏原是amba3花粉过敏原的异构体。

用现有的软件进行了硅致敏性分析，并给出了需要实验证实的结果。

在不同的实验研究中发现了Amb a3的IgE反应性[15-18]。bordasfloch等人发现，Amb a3是18%豚草过敏患者的过敏原，这一数字高于其他已知的轻微短豚草过敏原，如Amb a4、5,6,9和10 [5]。然而，实验证实的Amb a3的IgE表位尚未确定，Atassi和Atassi在Amb a3中发现了具有相当大IgE结合能力的区域。利用15个氨基酸长重叠的合成Amb a3多肽，他们采用定量免疫吸附滴定法得出结论，Amb a3的1- 15,21 - 35,31 - 45,51 -65和71- 85aa区域具有相当大的(5.3-30.8%)IgE结合能力[16]。除了W53缺失和r54k替换外，amba3和amba3的其他区域是相同的。验证蛋白程序评估W53和r54k对蛋白功能的影响为中性。因此，可以假设，这两种蛋白质可能具有相同的IgE表位。

有趣的是，虽然最近的研究未能在转录组学和蛋白质组学分析中检测到Amb a 3过敏原，但他们发现了一个高度相似的分子，在氨基酸末端部分有96.7%的氨基酸序列相同，但c端不同。这些发现与我们的结果一致，并表明豚草过敏原中存在Amb a 3异构体[5，15]。

Amb a3被认为是一种质体青素，而且保守结构域分析对质体青素样结构域有特异性命中，而对植物青素结构域无特异性。质体青素是参与电子转移的含铜蛋白质。植物蓝素也参与电子转移反应，并被分类为植物蓝或I型含铜蛋白质。Amb a 3-like保守结构域分析表明，Amb a 3-like对植物青蛋白有特异性命中，对质体青蛋白样结构域无特异性，因此认为Amb a 3-like属于植物蓝铜蛋白。Amb a 3-like的临时蓝铜样蛋白的非特异性命中进一步支持了这一建议。

Amb 3的核苷酸序列尚未发表。在转录组中，amba3样蛋白与amba3蛋白最为相似。Amb a 3-like基因的克隆及在雄花不同发育阶段的表达分析正在进行中。重组蛋白可用于蛋白质组学和免疫学研究，并与amba3进行比较。因此，我们期望所鉴定的核苷酸序列将有助于进一步研究Amb a3及其同源基因的植物基因组和免疫学。

确认

本研究由匈牙利科学院K100919 OTKA项目资助。

参考文献

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