研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
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农业微生物酶工程农业部重点实验室，河南农业大学生命科学学院，河南
收到日期:05/06/2015接受日期:17/12/2015发表日期:01/12/2015
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虽然乙醇来源于木质纤维素的生物质是一种很有前途的替代生物燃料，转化率高木糖由于许多常见酵母对木糖的利用效率不高，用发酵法生产乙醇并不理想。Pachysolen tannophilus可以同时将木质纤维素水解物中的己糖和戊糖如l -阿拉伯糖、木糖和葡萄糖转化为乙醇。提高玉米秸秆水解产物的转化率生物乙醇在此基础上，研究了P. tannnophilus中乙醇脱氢酶2基因(adh2)缺失对玉米秸秆水解物生产生物乙醇的影响。两个adh2删除剂(杂合子采用短侧翼同源PCR (SFH-PCR)构建ND和MC纯合子。ND和MC菌株的乙醇脱氢酶2 (ADH2)活性低于初始菌株P-01。在MC和ND发酵的戊糖和己糖中，乙醇浓度(g/L)分别为15.8和18.9，而初始P-01为14.6;而在玉米秸秆水解液中，MC和ND的乙醇浓度(g/L)分别为9.1和9.8，而初始菌株P-01为7.5。本研究为提高己糖和戊糖的转化效率提供了有用的信息。
乙醇脱氢酶2，粗索菌，基因缺失，乙醇生产，玉米秸秆。
世界日益增长的工业化和机动化导致了烟草消费的急剧增长化石燃料．然而，化石燃料不仅正在枯竭，而且对全球变暖也有重要贡献温室气体排放和全球变暖通过燃烧来满足能源需求，这导致了许多负面影响，包括气候变化，冰川退缩，海平面上升，损失生物多样性等。[1，2，3.］．因此，寻找可替代的、可持续的、排放更少的能源是一个紧迫的问题。
生物乙醇可能是最有前途的替代品之一生物燃料［4］．首先，它是环保的，因为当它与汽油混合燃烧时，可以减少一氧化碳、未燃烧的碳氢化合物和致癌物的排放[5］．其次，生物乙醇的辛烷值比汽油高。它不仅可以与汽油混合或在改进型火花点火发动机中燃烧，而且还可以改善汽油的性能，而且应用简单。4］．最后，生物乙醇主要由可再生和可持续的自然生物资源生产，如玉米、土豆、木薯和木质纤维素植物生物量[7］．然而，使用这种粮食和饲料作物来生产第一代生物乙醇是有争议的，因为与粮食供应的冲突[7］．第二代生物乙醇一般由农业木质纤维素生物质生产，这些生物质要么是粮食作物生产的不可食用残余物，要么是不可食用的整株植物生物量(例如，草或稻草)[4］．木质生物质中国每年产生各种作物秸秆约8亿吨，其中玉米秸秆和小麦秸秆分别占2.16亿吨和1.35亿吨[8］．生物乙醇不仅减少了对石油进口的依赖，而且由于其含氧量高，也减少了环境污染问题[9］．
潜在地，生物乙醇可以由发酵主要由纤维素组成的木质纤维素生物质水解产生的糖，半纤维素和木质素。只有纤维素和半纤维素可以转化为可发酵的糖，包括己糖和戊糖。木质纤维素生物质有效转化为生物乙醇需要最佳利用纤维素糖和半纤维素糖。目前，这两种类型的糖的发酵既可以通过共发酵进行，也可以通过戊糖和己糖的单独发酵进行，因为大多数天然存在的乙醇发酵微生物不利用戊糖。迄今为止，许多木糖发酵酵母，包括假丝酵母shehatae，毕赤酵母属stipitis而且Pachysolen tannophilus的木糖发酵能力已被广泛研究[10，11］．
p . tannophilus是第一个发现能从戊糖和己糖中产生乙醇的天然酵母[12］．p . tannophilus也被报道能够发酵所有常见的糖，如葡萄糖，甘露糖和半乳糖除了L-arabinose在半纤维素水解物中[13］．然而，大多数先前的研究p . tannophilus木糖利用途径[14，15］．在生物乙醇生产中，乙醇的最终浓度由细胞对乙醇毒性的抵抗力和乙醇氧化率决定。一般来说,酒精脱氢酶2（adh2)在酵母发酵过程中，当培养基中的糖被耗尽时，会催化乙醇氧化。因此，有一个有效的方法来增加乙醇浓度积累adh2删除。发酵过程中培养基中乙醇浓度稳定酿酒酵母与adh2缺失是因为缺乏张力adh2不能利用乙醇作为碳源[16］．在我们之前的研究中，用含有己糖和戊糖的培养基发酵84 h后，乙醇的积累明显减少p . tannophilus在最佳条件下P-01，和adh2在发酵过程中也检测到活性[17］．因此，我们假设的效果adh2删除乙醇生产p . tannophilus可能类似于酿酒酵母．
为了验证这一假设，我们设计了同源引物来克隆一个片段adh2从p . tannophilusP-01，然后得到全长adh2基因的快速扩增cDNA末端(RACE)。采用短侧链同源聚合酶链反应(SFH-PCR)进行删除adh2的p . tannophilus通过PCR对P-01和重组体进行验证。的影响adh2通过在玉米秸秆水解物中发酵初始菌株和重组菌来评估乙醇生产的缺失。
菌株和培养条件
p . tannophilusP-01用于adh2由河南农业大学筛选的玉米秸秆水解物去除发酵生产乙醇[18］．菌株在含(g/L)木糖20的液体培养基(pH 5.0)中，在28℃，150 rpm下生长;酵母提取物，3;胨,5。
克隆adh2从p . tannophilus
图1一个显示克隆全长的策略adh2RT-PCR和RACE方法。按照厂家说明书使用Trizol试剂(Invitrogen, Code: DP405-01)从菌丝中分离总RNA，并根据Takara RNA PCR Kit 3.0说明书合成cDNA。接下来，同源引物SF和SR (表1)用于克隆的部分片段adh2通过爆破adh2的酿酒kluyveri，毕赤酵母属stipitis、白色念珠菌和酿酒酵母来自NCBI (http://blast.st-va.ncbi.nlm)。nih.gov / Blast.cgi)。根据获得的cDNA片段序列，嵌套PCR引物(表1)通过使用5 '和3 ' -RACE试剂盒(Roche Applied Science，代码:PR6931, PR6921)分别进行3 '和5 ' RACE。最后，根据5 '和3 ' RACE的测序结果，设计引物JF和JR，获得全长adh2cDNA PCR产物。实验是按照制造商的建议进行的。所有PCR产物克隆到pMD18-T (TaKaRa, Code: D101A)简易载体上，在ABI PRISM 377 DNA测序仪上测序。
表1。用于adh2全长cDNA克隆的引物p . tannophilus，adh2删除和识别。
图1所示。(A) RT-PCR和RACE方法克隆全长adh2 cDNA的策略。采用同源引物SF和SR获得adh2的部分片段。嵌套PCR使用4对引物(3 ' RACE Outer引物和O-47, 3 ' RACE Inner引物和I-48, 5 ' RACE Outer引物和O-276, 5 ' RACE Inner引物和I-164)。引物JF和JR用于获取adh2全长cDNA。(B) SFH-PCR法基因缺失策略。低核苷酸NKF2和NKR2的5 '区域(颜色较深)包含约40个碱基，与目标基因匹配，而3 '区域(颜色较浅)与KanMX4盒式磁带匹配。这些嵌合寡核苷酸被用来转化p-01菌株。采用adh2引物YF和YR, KanMX4引物F14和R1559两对引物进行PCR鉴定。
SFH-PCR检测基因缺失p . tannophilusP-01应变
采用SFH-PCR方法，在p . tannophilusP-01 [19］．图1 b说明了具体的策略adh2基因破坏。可选择标记KanMX通常从载体pFA6a-KanMX4中获得，该载体包含从大肠杆菌转座子Tn903，能够赋予抗性卡那霉素在大肠杆菌和酵母中的基因素[20.］．以pFA6a-KanMX4质粒为模板，利用5 '端40个碱基对应的一对引物NKF2和NKR2扩增出缺失盒adh2和3 '端19基地匹配pFA6a-KanMX4(表1),进行PCR反应体积50μl组成的0.5μl的底漆,NKF2和NKR2(20μM), 4μl核苷酸(2.5毫米),5μl 10×PCR缓冲,10 ng pFA6a-KanMX4和0.5μl EXTaq(20μM),使用一个ptc - 200热循环(Bio-rad,代码:39855716)的项目5分钟在94°C, 30个周期(94°C的30年代45 65°C和90年代在72°C), 10分钟的最后一步,在72°C。经PCR反应DNA恢复试剂盒(TaKaRa，代码:DV807A)纯化后，SFH-PCR产物用醋酸锂法转化酵母二倍体细胞[21］．
验证转化者
验证SFH-PCR产物是否取代了adh2正确地，酵母转化子和初始菌株的染色体DNAp . tannophilus纯化P-01作为PCR模板。一对底漆，F14结合5 '端adh2和R1442结合KanMX4的3 '端(图1 b而且表1)的设计。PCR反应在94℃孵育5 min，然后在94℃孵育30次，在65℃孵育45 s，在72℃孵育120 s，然后在72℃孵育10 min，在Thermal Cycler中使用Taq聚合酶(NEB,5 U/ml)。
引物YF和YR结合adh2采用分析PCR方法验证纯合子(图1 b而且表1)．PCR反应在94℃孵育5 min，然后在94℃孵育30次，在65℃孵育45 s，在72℃孵育120 s，最后一步在72℃孵育10 min，在Thermal Cycler中使用Taq聚合酶(NEB,5 U/ml)。
遗传稳定性的adh2删除器也进行了测试。由于缺失子具有遗传蛋白(G418)抗性，可携带选择性标记KanMX，阳性缺失子，而不携带初始标记KanMXp . tannophilusP-01，可在含有10 g/L酵母膏、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂粉、80 mg/L G418的YPD培养皿上生长。
戊糖和己糖培养基发酵
比较MC、NM、MK和ND重组体与初始组合的乙醇产率p . tannophilus菌株P-01，在300ml玻璃瓶中加入100ml戊糖和己糖培养基，其中含有(g/L)葡萄糖4、木糖2、酵母汤0.3、蛋白胨0.5、尿素0.02和(NH4）2HPO40.01，用2 M H调整为pH5.52所以4， 120℃灭菌20 min。冷却至室温后，在28℃、120 rpm的摇床上接种1 ml重组菌(每个重组菌重复3次)96 h，然后测定乙醇含量。
玉米秸秆水解发酵
玉米是在中国河南鹤壁种植的。将玉米秸秆干燥后，用小型碎纸机粉碎，通过100目，并在以下条件下进行预处理:玉米秸秆粉100 g，蒸馏水600 ml，浓盐酸4.5 ml, 121℃，1h。用2M NaOH调整预处理溶液pH至4.8，在糖化槽中进行糖化处理，温度45℃，转速120 rpm，时间48 h，酶用量为2.4 × 104 U/g纤维素(SUKAHAN，代码:9042- 54-8)和5.3 × 104 U/g木聚糖酶(SUKAHAN，代码:9025-57-4)干物质。糖化用滤纸过滤后，添加以下氮源(g/L):酵母膏，3;蛋白胨、5;尿素0.2，再用2M NaOH调至pH 5.5。然后，将处理后的糖化液倒入300ml的玻璃烧瓶中，倒入90ml，在121℃下灭菌20 min。冷却至室温(24℃)后，p . tannophilus将菌株P-01、MC和ND重组体与9 ml培养物(每个菌株3次重复)在28°C、120 rpm的摇床上培养96 h，然后测定乙醇含量。
分析
的氨基酸序列p . tannophilusp-01adh2如我们之前的研究所述[22］．多个序列对齐和一个无根种系发生树氨基酸序列的adh2在MEGA version 6.0中生成，并使用1000次重复的bootstrap程序评估树节点的统计显著性[23］．的adh2热带假丝酵母(LOCUS: EER31030)、异毕赤酵母(LOCUS: CAH56496)、假丝酵母boidinii(地点:BAD12483),毕赤酵母属stipitis(地点:CAA73827),酿酒酵母(LOCUS: AAA34411)和酿酒kluyveri(位点:AAP51047)通过检索NCBI的公共数据库(http://www.ncbi。nlm.nih.gov)．采用DNS法测定玉米秸秆糖化液中还原糖的含量[24］．乙醇含量确定的安捷伦7890 a气相色谱仪(美国安捷伦)配备HP-FFAP (30 m×0.32毫米×1μm)列和火焰离子化检测器(GC-FID),列温度设定在45°C 1分钟55°C 10°C /分钟,1分钟,然后加热到80°C在15°C /分钟和0.5分钟,最后加热到120°C在20°C /分钟和1分钟。进样口和检测器的温度为200°C和250°C,分别。N注入量为0.2 μl，气体流速为1.5 ml/min2， 30 ml/min为H2空气350毫升/分钟。
酵母粗提物是用两倍重的氧化铝在冷条件下磨净细胞，然后用两倍重的50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)(含10 μM EDTA)提取。在20000 g离心20 min后收集上清液。ADH活性在25°C的比色皿中用20 μl粗提物和2.98 ml含有100 mM焦磷酸钠缓冲液(pH 8.5)、2 mM β-巯基乙醇、70 mM缩氨基脲和1 mM NAD+的反应混合物测定。向实验比色皿中加入100 mM乙醇，开始反应。在本实验条件下，酶单位表示为1 μmol NADH形成/min。ADH1和2同工酶之间的区分是通过前者从粗提物中热变性完成的，根据报道的方法[25］．通过测定乙醇脱氢酶的活性(总ADH活性)和(总ADH活性)前后测定提取物中两种同工酶的活性。adh2ADH1的活性是通过从总活性中减去同工酶2的活性得到的[26］．
克隆adh2从p . tannophilus
图2一个显示凝胶电泳adh2利用引物JF和JR对P-01进行完整的开放阅读框(ORF) PCR扩增p . tannophilusadh2编码351个氨基酸残基。利用ProtParam (http://au.expasy.org/tools/ ProtParam)软件计算得到蛋白质的分子量为35.137 kD，等电点为6.65。html)。的p . tannophilusadh2含有55.8%的疏水氨基酸，21.8%的亲水氨基酸，11.9%的碱性氨基酸和10.3%的酸性氨基酸。蛋白质结构adh2通过Prosite Server (http://kr.expasy.org /cgi- bin/ Prosite /ScanView)进行预测，锌结合位点位于47-157区域，NAD+结合域位于171-240区域。的守恒区域p . tannophilusadh2和另一个已知的相符吗adh2［27，28］．
图2。(A) PCR产物的凝胶电泳p . tannophilusP-01使用引物JF和JR。第1道:adh2，第2道:DNA梯子。(B)基于预测蛋白序列比对的无根系统发育树。这棵树被引导了1000次。
来研究之间的系统发育关系adh2在p . tannophilus及其在其他酵母菌株中的同源物，用热带念珠菌进行比对adh2，异常毕赤酵母adh2，假丝酵母boidiniiadh2，毕赤酵母属stipitis以及其他预测或公布的adh2可从GenBank获得。无根系统发育树在图2 b．的长度p . tannophilusadh2蛋白质含量与酿酒kluyveri，但相对较短假丝酵母boidinii或异毕赤酵母adh2蛋白质。p . tannophilusadh2发现有73%和71.6%的氨基酸序列相同毕赤酵母属stipitis和热带假丝酵母。其余四种酵母被分组在一起，但它们在一个独立的分支p . tannophilusadh2．
SFH-PCR检测基因缺失
图3引物为F14和R1442的部分重组体(NM, MK, ND, MC)和P-01 DNA扩增产物的凝胶电泳图。PCR产物凝胶电泳中，NM、MK、ND和MC菌株均有明显的4条条带，P-01菌株未出现条带，说明SFH-PCR产物被取代adh2这是因为引物F14和R1442与KanMX4互补。但是，该结果不能区分杂合子和纯合子。详见图4一在引物YF和YR的PCR产物凝胶电泳中，MC菌株未出现条带，而NM、MK、ND和P-01的PCR产物均出现明显条带，说明MC菌株为纯合子，其他3个重组体为杂合子。菌株MC和ND均能在80 mg/L G418的YPD板上生长至第20代，说明杂合子ND和纯合子MC均具有抗G418的表型。
图3。引物为F14和R1442的重组产物的凝胶电泳。1号线:DNA阶梯，2号线:菌株P-01, 3号线:重组NM, 4号线:重组MK, 5号线:重组ND, 6号线:重组MC。
图4。(A)引物YF和YR重组PCR产物的凝胶电泳。Lane 1: DNA梯，Lane 2:重组MC, Lane 3:重组NM, Lane 4:重组MK, Lane 5:重组ND, Lane 6:菌株P-01。(B)几种重组菌的发酵结果。戊糖己糖培养基(g/L):葡萄糖、木糖2、酵母汤0.3、蛋白胨0.5、尿素0.02、(NH4）2HPO40.01, pH 5.5;28°C, 120 rpm, 96 h P-01和NM, MC, MK, ND菌株。
发酵
图4 b介绍了P-01和NM、MC、MK、ND菌株在戊糖和己糖培养基上的发酵结果。ND菌株的乙醇产率(16.78 g/L)高于P-01和其他3个菌株。NM菌株的乙醇产率为12.97 g/L，与初始菌株P-01相近。MC的乙醇产率虽低于ND，但略高于初始菌株P-01。
经遗传稳定性试验，用20代P-01、MC和ND菌株分别发酵戊糖、己糖培养基和总还原糖含量为46 g/L的玉米秸秆水解物。表2分别用P-01、ND和MC菌株对戊糖和己糖培养基和玉米秸秆水解产物进行了乙醇产量测定。在戊糖和己糖培养基中，P-01、ND和MC的乙醇得率分别为65.7%、85.1%和70.9%。重组菌株ND和MC的乙醇产率分别比初始菌株P-01提高了29.53%和7.91%。在玉米秸秆水解液发酵中，ND、MC和P-01菌株的乙醇产率分别为57.8%、53.2%和43.9%。值得注意的是，在戊糖和己糖培养基中，ND、MC和P-01菌株对总糖、葡萄糖和木糖的利用差异不显著，但在玉米秸秆水解物中差异很大。杂合子菌株ND对总糖(62.05%)、葡萄糖(69.22%)和木糖(58.33%)的利用率高于野生菌株P-01，但在利用玉米秸秆水解物方面与纯合子菌株MC非常接近。表示删除adh2该基因不仅能提高乙醇产量，还能提高玉米秸秆水解产物中糖的利用率。
图5一个显示菌株P-01、ND和MC在戊糖和己糖发酵培养基中的ADH1活性。在发酵24 h后，杂合子ND菌株的ADH1活性明显高于ND和MC菌株，而纯合子MC菌株的ADH1活性在36 ~ 72 h最低adh2菌株P-01、ND和MC在戊糖和己糖发酵培养基中的活性。初始菌株P-01明显较高adh2在96 h时，杂合子ND的活性高于纯合子MCadh2发酵36 h后活性最高adh2在84 h时检测3株菌株的活性。
图5。(A) P-01、ND和MC菌株ADH1活性的比较。ADH1的活性由ADH总活性减去ADH2的活性得到。(B) P-01、ND和MC菌株ADH2活性的比较。根据Mauricio和Ortega的[26]方法测定ADH2活性。酶单位以1 μmol NADH形成量/min表示，在61°C孵育15 min前后，分别测定乙醇脱氢酶(ADH总活性)和(ADH2活性)的活性，测定提取物中两种同工酶的活性。
在这项研究中，测试的效果adh2删除乙醇生产p . tannophilus，我们克隆了全长adh2基因(adh2)p . tannophilus．乙醇脱氢酶(ADHs: EC 1.1.1.1)存在于多种生物中，包括动物、植物、酵母和细菌[27］．酵母中有5种醇脱氢酶(ADH1 ~ ADH5)，且有2种醇脱氢酶adh2表达受到葡萄糖生长的抑制，主要是由于参与乙醇消耗，将乙醇转化为乙醛[29］．目前，很少有关于adh2非传统酵母基因。值得注意的是adh2基因(DNA序列)p . tannophilus显示72%的身份adh2基因的p . stipitis．后者被克隆用于调查的重要性p . stipitis基因缺失代谢[30.］．实际上，基因缺失是酵母提高生物乙醇产量的一种有效方法。SFH-PCR已被证明是基因缺失和基因修饰的标准技术酿酒酵母［31］．据报道adh2删除在酿酒酵母可使乙醇产量较初始菌株提高2.5% [32］．
基于乙醇的结果表2P-01、ND和MC菌株在戊糖和己糖培养基中均能将葡萄糖和木糖共发酵生产乙醇，但木糖的利用率明显低于葡萄糖。很明显，发现的删除adh2与戊糖和己糖培养基共发酵对总糖、葡萄糖和木糖的利用影响不大。而在玉米秸秆水解物中，P-01、ND和MC菌株对糖类的利用趋势相似，但明显低于戊糖和己糖培养基。其原因可能是某些有毒物质的影响或戊糖和己糖配比不合适乙醇发酵．值得注意的是，突变株对玉米秸秆水解产物的糖利用率随着胁迫的增加而增加adh2删除。结果表明，玉米秸秆水解物中含有多种抑制酵母生长的有毒物质。一个可能的原因是adh2基因缺失增加了突变株对有毒物质的耐受性。另一个原因是糖代谢酶基因的表达上调adh2删除;但这些假设还有待进一步研究的验证。
玉米秸秆水解液的发酵结果也表明，杂合子ND的乙醇产率高于纯合子MC (表2)．突变体生产效率提高的可能原因是生产乙醇消耗的减少。从理论上讲，乙醇的利用率会降低，因为adh2删除，但乙醇代谢在p . tannophilus是一个涉及多种酶的复杂过程。事实证明，只有adh2删除从酿酒酵母不能对提高乙醇生产有很好的效果[33］．
图5一个结果表明，杂合子ND株的ADH1活性最高，纯合子MC株的ADH1活性也高于野生株P-01。这一结果表明adh2可能是增加ADH1活性的主要因素，但ADH1与adh2有待阐明。总的来说，ADH1可以在乙醇代谢途径中催化乙醛生成乙醇，杂合子ND的ADH1活性高于纯合子MC，这可能是杂合子乙醇产率较高的原因之一。然而，如图所示图5 b，轻微的adh2在纯合子MC中可以检测到活性，可能是由于同工酶或等位基因的存在adh2在p . tannophilus，但有一件事是肯定的:adh2删除减少了adh2在纯合子或杂合子中的活性。
今后的研究应重点利用双向电泳技术鉴定菌株MC、ND和P-01之间的差异表达蛋白质谱分析或开发更有效的基因改变策略，以分析影响乙醇生产的代谢中的关键酶。此外，通过将目的基因导入基因缺失的MC和ND菌株，可以提高玉米秸秆水解物的乙醇产量[34］．例如,p . tannophilus不能利用玉米秸秆水解物中存在的l -阿拉伯糖，但使用l -阿拉伯糖的酶可以引入p . tannophilus通过发酵木质纤维素水解物来提高乙醇产量。
在这项研究中，我们克隆了adh2从酵母p . tannophilus使用RACE方法。序列提交到NCBI数据库，登录号EU570211和EU590042。利用基因缺失技术SFH-PCR，研究了该方法的可行性adh2基因从p . tannophilus得到2个重组体(杂合子ND和纯合子MC)。的adh2在戊糖和己糖培养基发酵过程中，ND和MC菌株的活性均降低。ND和MC菌株经过20代以上的培养，均表现出稳定的G418抗性。玉米秸秆水解发酵结果表明，菌株ND(57.8%)和MC(53.2%)的乙醇产量均高于初始菌株P-01(43.9%)。本研究的总体结果为通过基因缺失提高玉米秸秆水解液乙醇生产提供了有用的信息。
本研究受到国家生物与医药技术领域高技术研究发展计划(863计划)(No. 2012AA022301B)和教育部新世纪优秀人才计划(No. 2012AA022301B)的资助。河南大学科技创新团队项目(15irtsthn014);
