设计和制造的仿真研究Hypoxia-Inducing室环境Bio-monitoring使用摇蚊属幼虫

文摘

的幼虫水生Chironomid蚊(双翅目,Chironomidae)已知淡水生境中生存暴露在压力特别是低氧压力。因此,研究影响溶解氧的含量的变化生理学幼虫可以帮助建立他们的潜在的淡水栖息地等敏感生物指标监测。简单廉价和non-cumbersome试验装置与商用在实验室设计和制造复杂的装配。这个设置的验证和血红蛋白水平变化进行热带物种蚊幼虫的摇蚊属ramosus暴露于低氧条件进行了研究。这是观察到有增加血红蛋白水平暴露于低氧条件和研究结果进一步验证通过研究血红蛋白基因的表达在不同的时间点在缺氧。这些发现表明,该设备设计可以作为一种廉价和有效的方法来生成和维护所需的溶解氧水平相比的几个常用的化学和物理方法。此外,这将是有用的监测研究中要做的缺氧在淡水栖息地利用摇蚊属血红蛋白作为生物标志物。

关键字

摇蚊属ramosus淡水,血红蛋白,缺氧,环境生物监测

介绍

缺氧在淡水生态系统经常威胁生命形式蓬勃发展在这种水生栖息地。缺氧或低溶解氧条件下可能出现的结果增加温度、沉积的废水,排放污水处理厂和几位等因素1,2]。引入营养物质最终导致富营养化导致缺氧条件下的水体由于分解死藻大规模[3]。因此,在当前情况下的稳定增长在全球生态威胁淡水生态系统、水生生态系统中的溶解氧含量的波动是成为一个相关的问题4- - - - - -8]。在这种背景下,节肢动物,尤其是水生昆虫已成为合适的模型为研究低氧应激和全球变暖导致气候变化9- - - - - -12]。

在水生冷血动物,chironomid蚊幼虫已被证明是一个有用的模式生物,构成了一个重要的集团在全球范围内现有的宏观底栖生物。的non-biting蚊属摇蚊属是一种最丰富的昆虫中发现淡水生态系统集团(13- - - - - -15]。而陆地成年人蚊寿命较短的几天,水生蚊的幼虫组成最长的阶段生命周期。因为这些幼虫与其他水生生物形式共存了几天,它们形成水生食物链的一个非常重要的组成部分。他们是美联储在几个淡水鱼类和水生甲虫以及其他食肉昆虫。在环境生物监测的背景下,由于重要性Chironomid幼虫特别得到了他们的缺氧环境中的生存能力16- - - - - -19]。因此研究人口密度波动的幼虫,死亡率和发病率增加其他形态,生理和生化幼虫的变化可以提供一个洞察这种栖息地的生态环境。幼虫在水生栖息地生存的能力与低溶解氧含量归因于存在高的内容呼吸血红素在血淋巴20.- - - - - -23]。幼虫哼哼淋巴研究表明血红蛋白构成了大约90%的总哼哼淋巴蛋白(24]。幼虫的血红蛋白合成发生在脂肪体,然后分泌入血淋巴。因此,发现幼虫血红蛋白在血淋巴内自由流动与大多数高等脊椎动物生物。此外,幼虫血红蛋白主要是发现单体和二聚体在幼虫血淋巴25,26]。能找到一些开创性的研究文献中,摇蚊属血红蛋白(ChHb)已被证明作为环境毒物和缺氧的指标(27,28]。虽然一直试图开发设备用于监视缺氧水样,这些设备是用户友好的,大部分都是劳动密集型29日- - - - - -31日]。这样的实验室研究监控变化发生在生物因缺氧条件需要需要商会提供稳定的模拟实验条件。商用氮气体处理装置繁琐和昂贵的使用在一个小规模的研究涉及青少年的无脊椎动物如昆虫幼虫阶段。因此需要一个房间来满足特定的需求。的设计和制造hypoxia-inducing暨生物监测和模拟室摘要报告。制造商会验证和宽容的测试生物体不同程度的溶解氧(做)监控。自做水平低于2 ppm称为缺氧水生栖息地(32),生存在ppm水平2 ppm下面进行测试。血红蛋白含量的变化和ChHb基因的转录水平随着时间的推移,由于缺氧监控使用这个室和结果报告。这些实验室模拟研究有助于利用蚊幼虫在水生淡水生态系统的潜在指标缺氧。

材料和方法

生物

第三龄幼虫摇蚊属ramosus,热带昆虫蚊物种被用于本研究。Isofemale行C ramosus都维持在25±2°C和14 h: 10 h黑暗周期。幼虫被纳补充食物所述,Godbole [33]。

缺氧的设计安装

一个矩形聚丙烯盒10英寸×7英寸×4英寸(l××b d)维度被用作室的幼虫在治疗。室有一个容量为5升(图1)。然而,2升蒸馏水被用于实验报告。可以引入氮气压力控制管连接到水生系统的氮气瓶装有压力阀。使用扩散器的引入氮入水中。开放,允许引入溶解氧测定仪探针在室的墙壁。带盖子的矩形框提供了可以关闭和材料,如封口膜可以用于密封盒和盖子之间的接触点,氧气水平达到可以长期坚持。雷竞技网页版

公差测试机体缺氧

的宽容和幼虫的生存水平的2 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0.25 ppm和0 ppm进行了研究。这项研究是由幼虫引入包含水的试验箱做的水平测试。幼虫在不同时期的生存到24小时暴露于低氧被记录。幼虫表现出运动以及对触觉刺激作为幼虫活着的迹象。30幼虫都是用于每个实验和实验进行了一式三份。

测量血红蛋白含量

血红蛋白含量作为时间的函数的暴露的幼虫缺氧是由测量俗峰值(λmax = 415海里)(34- - - - - -36血红蛋白的幼虫血淋巴中。经均质化30幼虫血淋巴,暴露的一个给定的时间点,在磷酸缓冲(pH值7)。匀浆在12000转离心20分钟,同时保持温度在4°C。上层清液的吸光度值415海里被分光光度法测量使用ELISA板读者(美国佛蒙特州Biotek仪器公司)。

RNA隔离和RT-qPCR

整个幼虫(n = 5)在700年被均质μl TRIsoln试剂(默克公司)和总RNA分离按照制造商的标准协议。的过程中,RNA获得50μl resuspended核酸酶游离水。使用板进行了量化spectrophotometrically读者(美国佛蒙特州Biotek仪器Inc .)。量化后,2μg总RNA被用来合成cDNA使用互补脱氧核糖核酸合成装备(SD神童)遵循制造商的协议。的总量cDNA反应是20μl。互补脱氧核糖核酸合成、年底30μl核酸酶自由无菌水补充道。2μl cDNA使用引物序列用于RT-qPCR分析之前所描述的李et al。27]。加入Hb(基因库。X56272 - F: 5 'ttgagattccacggttgtga3 ';R: 5 'aagttgacatccttgctgcc3”)和肌动蛋白(加入基因库。AB073070 - F: 5 'gatgaagatcctcaccgaacg3 ';R: 5 'ccttacggatatcaacgtcgc3”)。在场的几个亚型的Hb摇蚊属幼虫,的一个亚型表达进行了研究。2μl cDNA模板混合2μl每个正向和反向引物和10μl SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad)。反应混合物的体积是20μl添加4μl核酸酶自由无菌水。RT-qPCR期间使用的反应条件如下:2分钟首次变性在95°C, 40周期30秒变性在94°C, 30秒退火60°C和30秒在72°C扩展。 A 5 min final elongation step at 72°C was the last step in the reaction. All samples were analysed as triplicates and the Ct values were calculated. Expression of the actin gene was used as reference for normalization. mRNA levels in the samples were represented as fold induction relative to the control value (set to 1).

统计数据

统计分析是使用IBM SPSS版本20软件完成的。

结果与讨论

测试室Hypoxia-Inducing功效的

这是观察到氮气体处理1 psi的稳定压力导致溶解氧含量逐渐减少在测试室。在实验的开始做记录级别的5.73 ppm。10分钟后气体从一开始介绍,做内容达到了1.14 ppm,在接下来的20分钟的价值进一步下降到0.35 ppm (图2)。五个复制进行观察,约0.3 ppm的缺氧条件可以达到30分钟内开始的实验。类似的设置没有氮气泡沫被用作控制。研究结果表明,组合试验装置可以作为hypoxia-inducing室仿真实验。气体流量控制的方式,这样做的内容能保持在所需的范围内使用设置。因此,它提供了一个可能性进行模拟研究水生生态系统不同的氧气浓度。

公差测试机体缺氧

测试生物体(n = 30)被暴露于不同内容和幼虫的生存是在不同时间点到24小时监控。生存的情节幼虫在不同的实验内容2 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0.25 ppm和0 ppm显示的最低浓度在幼虫显示的最大生存是0.5 ppm,而死亡率为0.25 ppm和0增长ppm。情节展示幼虫的生存重建的幼虫的事实摇蚊属在缺氧条件下能够存活的时间太长(图3)记录在过去的许多研究[14,16,19]。以来最低的观察做的最大公差是0.5 ppm,暴露于0.5 ppm被选中作进一步研究。

改变的Hb内容作为时间的函数暴露于低氧条件

测定幼虫暴露于低氧的血红蛋白含量(0.5 ppm)显示约25%的显著变化基本以24小时为周期的结束与幼虫暴露normoxia同时段(p < 0.005) (图4)。血红蛋白含量被表示为每毫克μg幼虫。Hb测量了幼虫暴露在各自的条件2,4,8 - 24小时。幼虫暴露于低氧的血红蛋白含量显示相比增加幼虫在常氧条件下每一个时间点。

缺氧对Hb基因表达的影响

RT qPCR分析显示,有一个ChHb基因表达的转录水平增加时,幼虫受到缺氧时间增加到24小时。结果表明,有一个的表达水平增加暴露在缺氧的Hb历史点重要4小时和24小时的增加(p < 0.05) (图5)。

结论

的幼虫摇蚊属俗称红蚯蚓由于存在高含量的血红蛋白血淋巴记录在氧含量较低的水生栖息地生存。领域的研究在这些幼虫在几个实例进行了重点的废水引入这些天然水体。然而,为了建立特定的溶氧水平的变化的影响在水生周围这些幼虫存活,需要进行这些实验在实验室控制条件下。室进行这样的实验,内容可以轻易改变会促进此类研究。hypoxia-inducing室设计和制造的疗效评估和室的有效性在获取和保持较低的内容在一个水的身体了。缺氧对热带蚊物种的影响摇蚊属ramosus表明,幼虫低见0.5 ppm是宽容的。暴露的幼虫0.5 ppm研究了随着时间的推移,对生理、生化和分子参数。有一个稳定的增长在Hb内容在最初几个小时的治疗由基因表达研究证实ChHb基因的转录水平。性能测试表明这样一个室模拟自然缺氧水生栖息地导致Hb的改变摇蚊属幼虫重申了研究缺氧的影响,过去已报告。因此它可以作为一个可靠的simulatory援助等研究栖息地利用ChHb作为参数。最后,这里描述的hypoxia-inducing室捏造和廉价和有效的设备生成和维护缺氧对水生生物监测研究幼虫。这种方法也提供了一个很好的替代传统繁琐的缺氧诱导的化学和物理方法。

确认

作者感谢霍米巴巴的生物学奥林匹克运动会实验室科学教育中心TIFR、孟买和动物学,s·p·普纳大学物流和基础设施支持(DRDP DST-PURSE和UGC-CAS-III)以及应急和旅游支持SPPU-BCUD格兰特(2016 - 18)。作者也感谢车间员工HBCSE帮忙制造设备。我们还要感谢杰西塔博士D’索萨UM-DAE CBS,孟买物流帮助开展RT qPCR的实验。

利益冲突

作者声明,这里的工作报告没有任何的利益冲突。

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