检测和量化的Uromyces setariae-italicae谷子的实时PCR分析

文摘

生锈是一个植物病害这提出了一个严重的问题谷子自1980年以来,种植在中国北方。在这项研究中,我们开发了一个实时的荧光、定量PCR分析精确量化的基因组DNA, setariae-italicae rDNA基于其地区的基因。结果分析高度物种特异性,并对其他真菌分离株的DNA。的极限分析的量化是10 fg /μl,它能够检测出锈真菌在谷子叶片6 h后接种。这个工作主要是关于检测的分子工具的发展美国setariae-italicae并将有助于锈谷子感染的诊断。

关键字

Uromyces setariae-italicaerDNA区域,实时荧光定量PCR。

介绍

谷子(Setaria italica测定)是一个二倍体和自花受粉谷类作物(1]。据报道,谷子起源于中国,有7300多年的历史2]。锈病是一种严重的植物病害,影响谷子(Setaria italica (l)p .测定)在世界各地。它是由真菌病原体的顺序Pucciniales(原锈菌目)。的重要粮食作物谷子是广泛寄生Uromycessetariae-italicaeYosh;锈病流行年收益率影响显著,与易感品种经历的损失超过30%,甚至完全丧失的极端的生产影响最严重的地区(3,4]。

美国setariae-italicae有一个广泛的主机,包括属Brachiaria、Cyrtococcum Eriochloa、Melinis Ottochloa,黍,Paspalidium, Setaria Urochloa(3]。物种间的Setaria, s . italica冬青,s . verticillata s geniculata s pallidefusca s poiretiana rubiginosa和spacelata都被记录为主机的铁锈5,6]。众所周知的病原体美国italica由于经济这种植物的重要性。然而,尽管其突出的作用植物病原体现代分子的详细研究美国setariae-italicae仍然缺乏和现代检测技术是必要的。

快速检测和正确识别对植物病害的预防很重要。锈真菌物种很难确定在疾病发展的早期阶段根据疾病症状或夏孢子形态。分子的方法,如传统聚合酶链反应(PCR)序列分析,可以是有用的,但往往是劳动密集型的,可能需要几天来确认身份的一个示例。实时PCR是一种公认的诊断技术,促进了植物病害诊断(7,8,9]。除了提供定量数据,qPCR更敏感,速度比常规PCR,使它适合于量化的病原体感染的寄主植物的DNA组织。

本研究的具体目标是开发一个特定的和敏感qPCR快速定量分析美国setariaeitalicae在谷子样本。

材料和方法

真菌的集合

分离的病原体美国setariae-italicae和其他植物病原体包括Sclerospora graminicola, Pyricularia setariae、辣椒丝、黑粉菌属crameri, Bipolaris setariae, Curvularia lunata和尾孢属setariae收集从谷子种植园位于石家庄,河北省,把小米研究所,河北农业和林业科学院石家庄,中国。其他铁锈物种包括柄锈菌striiformis,茎杆,p .深奥的,p . polysora, p . sorghi也把小米研究所、河北农业和林业科学院石家庄,中国。

DNA提取、扩增和测序

基因组DNA从夏孢子中提取是如前所述的王et al。10]。其他病原体的基因组DNA提取的方式类似。rDNA其地区放大使用通用引物对ITS1 5 - TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3和ITS4 5”——TCCTCCGCTTATTGATATGC-3”。放大在25-μl进行卷包含12.5μl 2×Taq MasterMix(北京ComWin生物技术有限公司,中国),1μl每个引物(10μM), 1μl DNA模板和9.5μl无菌高纯度的水。热循环条件是一个初始变性步骤5分钟在95°C,紧随其后的是35周期94°C的30年代,55°C 30年代,72°C 1分钟,最后在72°C扩展步骤10分钟。PCR扩增分析了产品在1.5%琼脂糖凝胶和gel-purified使用TIANgel Midi净化设备(TIANGEN生物技术有限公司、北京、中国)后,制造商的协议。纯化PCR产品被绑定到一个pMD19-T向量(豆类生物有限公司、大连、中国)和转换成大肠杆菌DH5α。阳性克隆选择和重组质粒测序由Sangon生物技术有限公司有限公司(上海,中国)。结果DNA序列提交基因库。

引物设计和特异性Q-PCR的考验

引物序列Q-PCR分析美国setariae-italicae是基于测序rDNA地区。正向和反向引物的序列RT-F (5 ' - GGTGCACTTAATTGTGGCTCAA 3 ')和RT-R (5 ' - CTCCTTTTCTTTTTCCCTCTCAAA 3 ')。Q-PCR放大和检测样本进行了AB StepOne实时PCR系统。Q-PCR系统SYBR绿色检测优化包含10μl 2×20μl反应SYBR预混料(豆类,大连,中国),0.4μl火箭参考染料,0.8μl每个引物(10μM), 2μl cDNA模板(100 ng /μl)和6μl核酸酶游离水,根据制造商的指导方针。控制反应包含相同的混合物,用2μl无菌水取代DNA模板;三个技术复制每个样本进行。放大的样本是基于下列条件:50°C 2分钟,10分钟95°C,和40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。每次运行后,产品的融化曲线收购来检查扩增特异性通过增加温度为15秒95°C, 1分钟降低到60°C,然后增加了0.3°C / s - 95°C 15 s连续测量的荧光。确定特定引物美国setariae-italicae,他们也对其他铁锈物种的DNA,包括测试柄锈菌striiformis,茎杆,p .深奥的,p . polysora, p . sorghi和其他真菌隔离美国italica包括Sclerospora graminicola, Pyricularia setariae、辣椒丝、黑粉菌属crameri, Bipolaris setariae, Curvularia lunata和尾孢属setariae使用常规PCR和Q-PCR。

敏感性测试和标准曲线的生成

我们使用10倍稀释系列从10 ng /μl 10 fg /μl美国setariae-italicaeDNA测试一对引物的敏感性。这锈物种生成的标准曲线绘制x轴上的已知DNA浓度的对数与C_t价值产生的二阶导数(2^ndderivative-C_t)在y轴上。简单线性回归,Q-PCR反应效率,确定系数(R2)和标准偏差的DNA浓度计算使用AB第一步软件(版本2.0)。

定量检测病原体的小米树叶

谷子品种的Yugu1锈真菌接种。当植物在六、七叶的生长阶段,接种是由喷涂生锈夏孢子(5×10⁶孢子/毫升)。接下来,植物培养48 h在28°C在黑暗中相对湿度95%,然后孵化28°C下光周期14 h光和10 h黑暗的光强度6000勒克斯。叶采集标本在0 6 18、30、36、42和72 h后接种。提取基因组DNA的谷子叶片。病原体在小米叶子的数量是根据标准曲线计算出的基因组DNAUromyces setariae-italicae。

结果

扩增、克隆和测序

PCR扩增rDNA的地区是成功的,并导致了PCR产品727个基点。DNA序列提交基因库,KJ755671加入代码。

Q-PCR的特异性引物

的特异性引物对其它植物的DNA测试病原体。特定PCR的DNA片段被放大美国setariae-italicae,而不是从其他真菌分离株的DNA和消极的控制(图1一个)。Q-PCR化验也没有放大DNA从其他非目标植物病原体,事实证明了只有一个峰值的解离曲线(图1 b)。

的敏感性Q-PCR试验和标准曲线

Q-PCR的敏感性分析是评估使用串行稀释基因组DNA已知浓度的标准(从10 ng /μl到成品/μl) (图2一个)。一个标准曲线生成使用一系列基因组DNA的标准从104 pg /μl pg /μl 10。量化显示一个线性协会(R²= 0.995)日志之间的DNA浓度和C_t值范围的DNA浓度检查。与纯粹的模板DNA扩增效率为97.58% (图2 b)。

的评估Uromyces setariae-italicae发展接种谷子树叶

DNA的浓度低至10 fg /μl可以检测表明测定是高度敏感的(图2一个),标准曲线的基因组DNAUromyces setariae-italicae显示日志的DNA浓度之间的线性关系和C_t值(图2 b)。因此,量化系统已成功应用于检测谷子锈真菌。

在我们的研究中,美国setariae-italicae检测在谷子与uredinospores接种后6小时,和真菌DNA的数量每克小米叶子0.03 ng (图3)。随着接种时间的增加,真菌DNA的数量增加小米树叶。病原体的快速增长,与广泛的病变的发展。

讨论

实时pcr真菌量化分析的其他植物病原体之前出版。四种常见谷物和草生锈的病原体,小麦锈菌p . recondita f . sp. secalis, p . striiformis和p . triticina识别和检测使用Q-PCR [11]。Gachon等人开发了一种高度灵敏的Q-PCR试验得分疾病进展拟南芥感染了真菌病原体链格孢属brassicicola和葡萄孢菌(12]。我们的报告是第一个成功地检测和量化的病原体美国setariae-italicae在中国使用实时PCR谷子。实时PCR的灵敏度高于标准PCR。以前,王等人用常规PCR检测柄锈菌striiformis,实现10 pg的DNA的检测极限(10]。当锅等人使用实时PCR评估相同的物种;检出限是100 fg,所以灵敏度(增加了100倍13]。据Q-PCR底漆对量化的极限是10 fg基因组DNA,用这项技术提供一个很好的灵敏度。同样,巴恩斯等人报道0.053 pg检测的能力茎杆使用实时PCR检测DNA,郭等人发现丝核菌cerealisat量低至100 fg净化病原DNA使用实时PCR (11,14]。这种改进的敏感性是一个重要的发展,因为它使少量的目标病原体检测的DNA,因此提高了评估生锈真菌发展在谷子组织从第一阶段的感染。在我们的研究中,rDNA区域放大使用底漆一对ITS1和ITS4,但是引物对不适合Q-PCR因为它产生727个基点的扩增子,这对Q-PCR[太长15]。因此,我们开发了一双合适的引物测序的地区,具体美国setariae-italicae。两人对其他铁锈物种的DNA测试和植物真菌,也没有放大这些物种的DNA检测,表明所设计的引物确实是特定于我们的目标物种的DNA。

检测和量化的方法美国setariae-italicae我们将成为一个有用的工具为未来研究开发的病原体种类。这些Q-PCR方法有潜力用于监测谷子的铁锈感染组织,预测真菌传染病的发展,和学习fungi-plant交互。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(820055)和应用技术研究和开发的项目在黑龙江(2014号g0173)。

引用

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