俄罗斯前列腺癌患者手术材料中16型人乳头瘤病毒E7致癌原的检测

Galina M Volgareva^＊，瓦莱里娅·D·埃米洛娃^＊＃，亚历山大五世哈恰图良，维克托五世塔塔尔斯基，Vsevolod B Matveev和Larisa S Pavlova

NN Blokhin俄罗斯癌症研究中心，俄罗斯联邦卫生部，俄罗斯莫斯科

^＃两位作者的贡献相当

*通讯作者:: Galina M Volgareva
俄罗斯联邦卫生部NN Blokhin俄罗斯癌症研究中心
莫斯科,俄罗斯
电话:00 7 495 324 1205
电子邮件: (电子邮件保护); Valeria D Ermilova
俄罗斯联邦卫生部NN Blokhin俄罗斯癌症研究中心
莫斯科,俄罗斯
电话:00 7 495 324 1205
电子邮件: (电子邮件保护)

收到的日期: 06/04/2017;接受日期:21/04/2017;发布日期: 28/04/2017

摘要

前列腺癌(PC)是全球男性第二大常见恶性肿瘤。目前还没有关于PC开发原因的澄清。长期讨论的PC可能与致癌人乳头瘤病毒(HPV)有关的问题仍有争议。这项研究的目的是通过PCR检测俄罗斯PC患者的手术材料是否含有HPV16的E7致癌基因，HPV16是导致宫颈癌的主要HPV类型。对17例前列腺癌根治术中切除的前列腺冷冻切口进行显微解剖。在7例患者中发现了HPV16 E7，包括从癌细胞的同质位点分离出DNA的5例病例。所获得的结果似乎对阐明PC病因以及制定预防措施具有重要意义。

关键字

前列腺癌病因学，人乳头瘤病毒，致癌基因E7

介绍

其次是前列腺癌恶性肿瘤包括俄罗斯联邦在内的世界各地的人民[1，2］．在过去十年中，俄罗斯所有男性肿瘤中PC发病率和死亡率的上升率最高[2］．关于个人电脑发展的原因还没有全面的澄清[3.］．一组可能的PC病原体可能是致癌人类乳头瘤病毒[4-6］．这里值得一提的是，42%的俄罗斯健康男性泌尿生殖系统中发现了致癌hpv [7］．尽管PC与HPV的可能关联是一个长期讨论的问题，但仍然没有解决。它的主题不能被高估:如果PC与高危hpv的关联被证实，前景似乎可以通过免疫接种为预防子宫颈癌而接种疫苗的男孩。

对于感染致癌hpv的宫颈上皮细胞的恶性转化，这是由于由两个相应的病毒致癌基因编码的两种病毒蛋白E6和E7的活性引起的。这些蛋白质分别使细胞肿瘤抑制因子p53和pRB失活。宫颈细胞失去了控制增殖、凋亡、DNA修复等重要功能。导致50%以上CC病例的最常见的致癌HPV类型是HPV16 [8，9］．这项工作的目的是通过PCR检测HPV16癌基因E7是否存在于根治性前列腺切除术患者的手术材料中。为了更好地保存DNA，这项研究是在冷冻保存的前列腺组织上进行的(没有用福尔马林或石蜡处理)。由于前列腺癌多灶性生长是其特征，形态学家(V.D.E.)在切割过程中首先在宏观上发现前列腺病理改变区域，然后进行如下所述的微观解剖。据我们所知，这是使用冷冻保存的PC标本结合微解剖检测PC中HPV DNA的开创性尝试。

材料与方法

使用17例前列腺癌患者的前列腺。腺体是在Blokhin俄罗斯癌症研究中心泌尿科进行手术切除的。患者年龄52 ~ 69岁，血清PSA指数在4.6 ~ 42.0 ng/ ml之间，Gleason评分为6 ~ 8分。这些特征以及TNM肿瘤分期的意义在表1，列2-5。术后1-2小时内切除前列腺病理改变区;将宏观检测到异常的组织片段放入冷冻室(-60°C)，用于HPV E7检测。低温切割和显微解剖DNA隔离按照Guo等人稍作修改的程序进行[10］．将每个冷冻组织碎片连续切割2个5 μm厚的切口，放置在两个不同的物体玻璃上。其中1例用苏木精-伊红染色，镜下显示正常上皮区、异常增生区和PC区。在其盖玻璃上做了相应的标记。第二次切割未染色，未遮盖，在放大镜下进行微观解剖，并考虑到第一张幻灯片上的标记。为了避免污染，每隔一段都要用新手术刀。在绝大多数情况下，单个区域在给定的载玻片上进行微观解剖。唯一的例外是N1病人。在这种情况下，从对应于Pin I和Pin III的两个区域分离DNA是可能的。

病人没有	年龄、年	TNM阶段	血清PSA (ng/ml)	Glea-son得分	术后组织学资料	低温切片组织学资料	hpv16 Е7 PCR检测结果
1	52	T2N0M0	5.9	7	小腺泡癌	销我	+
						第三针	+
					中分化性腺癌
2	60	T2N0M0	8.1	7		第三针	-
					小腺泡癌
					——«
3.	56	T2N0M0	9.3	6	——«	第三针	-
4	64	T2N0M0	5.2	7	——«	第三针	-
5	52	T2N0M0	42.0	6	——«	第三针	-
6	63	T2N0M0	4．7	6	——«	个人电脑	+
7	63	T2N0M0	6．0	6	——«	第三针	-
8	66	T2N0M0	12.6	6	——«	个人电脑	+
9	63	T3N0M0	4．9	6	——«	第三针	-
10	68	T2N0M0	42.0	7	——«	个人电脑	+
11	69	T2N0M0	32.8	7	——«	个人电脑	+
12	67	T2N0M0	8.4	6	治疗pathomorphosis	正常组织	-
13	58	T2NxM0	22.8	8	小腺泡癌	腺病	+
14	55	T3N0M0	34.0	7		正常组织	-
15	68	T2N0M0	5.5	7		良性增生	-
16	63	T2N0M0	8.4	8			-
17	65	T2N0M0	4.6	7			+

表1。患者临床资料;HPV 16癌基因Е7检测结果。

收集的细胞在55℃下用蛋白酶K溶液(500 μg/ml，“Helicon”，俄罗斯)在Tris-HCl缓冲液(0.01 М Трис- HCl, pH 8.0, 0.001 M EDTA, 0.5% Tween20)中裂解过夜。在95ºС温度下，将裂解液加热10分钟，使酶失活。DNA分离的成功受控于GAPDH基因的PCR引物:正向(5 ' - ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC - 3 ')和反向(5 ' - TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA - 3 ')。扩增产物长度为450 bp。放大程序如下:94°С - 5 min，循环28次，94°С - 30 sec, 58°С - 30 sec, 72°С - 60 sec;最后伸展2分钟。

对于HPV16 E7的检测，应用了前面描述的程序[11］．使用了以下类型特异性引物:sense, 5 ' - CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT- 3 ';反义，5 ' - gaa CAG ATG GGG CAC ACA AT - 3 '。扩增产物长度为144 bp。程序是这样的:94°С - 4分钟;然后三步35个循环:94°С - 30秒，58°С - 30秒，72°С - 90秒;总结拉伸6分钟。

HPV16 e7特异性引物PCR阳性对照使用携带HPV16的CC标本的DNA;以不含DNA的反应混合物为阴性对照。如果在两个对照中都获得了足够的结果，则登记数据。扩增后的DNA片段用电泳在1.5% (GAPDH)或2.0% (HPV16 E7)琼脂糖凝胶中，溴化乙锭存在(0.5 μg/ml)。

PCR在“Tertsik”(“DNK tekhnologii”，俄罗斯)仪器中进行;在Image Quant Las 4000(“GE Healthcare”)的帮助下对pcr产物的电泳结果进行分析和注册。

结果与讨论

在研究中，16例前列腺癌患者经手术后腺体组织学分析结果证实(表1(第6列)。其中15例为小腺泡癌，1例(N2例)为中分化腺癌。未检出癌症前列腺癌N14患者组织:大面积的纤维化，少量的淋巴浸润和罕见的萎缩导管构成了癌症总的治疗病理形态。对用于显微解剖程序的两个系列切口之一进行显微分析的数据表1，第7栏。5例(6、8、10、11、17例)均为PC区。另有7例(1 ~ 5例、7例、9例)为pin，其余标本为正常前列腺组织(12例、14例)，良性增生(15、16例)和腺病(13例)。PCR检测17例患者中有7例存在HPV16 E7。所有5例PC病例均为阳性，患者1的两个pin均为阳性(表1和图1)．

reports-in-cancer-and-treatment-amplification

图1:E7型hpv16特异性引物PCR扩增产物电泳图。1-HPV16 - CC阳性(阳性对照);2 -患者1的Pin I;3 -患者1的Pin III;4 -阴性对照。

我们对有限数量的PC患者进行了研究，特别注意最大限度地保存DNA，并检查了均匀组织带，结果证明了致癌HPV16可能经常出现在前列腺异常部位。L Yang等人对文献数据的meta分析结果证实了HPV的全球流行与PC的相对风险之间的联系，但强调由于地理区域、标本类型、检测方法、Gleason评分等许多参数的影响，结果不确定性。[12］．鉴于上述问题对实际保健的紧迫性，值得进一步研究。正如乳头瘤病毒致癌研究先驱H zur Hausen教授在其诺贝尔奖演讲中所强调的那样，我们目前对全球癌症负担与包括病毒在内的感染因子之间的联系的理解可能远远不够全面。13］．在这方面，似乎值得在此提及的出版物表明，在一些广泛存在的癌症类型中存在致癌hpv:肺癌[14，15]、乳癌[16-18]、膀胱癌[19，20.］．我们以前的经验表明，对于有争议的情况，在mRNA和/或蛋白质水平上验证病毒基因组表达的事实似乎是合理的[11，19］．这些发现对于实用肿瘤学的重要性，即预防手段或将肿瘤HPV状态作为预测标志物的应用，可能会在以后的进一步研究过程中变得清晰。

结论

结果表明，在俄罗斯前列腺癌患者的前列腺中，HPV16致癌性并不少见。他们是感兴趣的两个PC病因阐明和制定PC的预防措施。致瘤hpv参与PC发生的可能性值得密切关注和进一步研究。

参考文献

托瑞等人。全球癌症发病率和死亡率及其趋势——最新情况。癌症流行病学生物标志物，2016;25:16-27。
Kaprin等。2014年俄罗斯恶性畸形(发病率和死亡率)。莫斯科。2016;250年。
Imyanitov EN。前列腺癌的流行病学和生物学。实用肿瘤学。2008; 9:57 - 64。
里昂。国际癌症研究机构关于人类致癌风险评估的专著。人乳头瘤病毒，2007;90:689。
里昂。国际癌症研究机构关于人类致癌风险评估的专著。人类致癌物研究综述。B.生物制剂，2011;100:502。
前列腺癌:乳头瘤病毒是可能的病因。俄罗斯医学科学院年鉴，2015;70:95-100。
斯梅洛夫V等人。男性前列腺分泌物表达在人乳头瘤病毒流行病学研究中的应用PLOS One, 2013;8:625-630。
这苏珥是HH。乳头瘤病毒与癌症:从基础研究到临床应用。癌症。2002;2:342-350。
这苏珥是HH。疫苗接种等等。生物化学(莫斯科)。2008; 73:498 - 503。
郭忠，等。染色体3p缺失瘤内异质性分析及宫颈癌多克隆起源的遗传学证据。《现代病理学》2001;14:54-61。
Golovina DA，等。分子遗传学和免疫组化的复合方法检测膀胱癌上皮中人乳头瘤病毒。公牛Exp生物医学。2014;157:70-73。
杨林，等。人乳头瘤病毒的全球流行率和前列腺癌的相对风险:一项荟萃分析科学通报2015;5:14667。
这苏珥是HH。寻找人类癌症的感染原因:在哪里和为什么(诺贝尔演讲)。中国生物医学工程学报(英文版);2009;
Srinivasan M，等。人乳头瘤病毒16型和18型在原发性肺癌中的meta分析致癌作用。2009;30:1722 - 1728。
Ragin C，等。hpv相关肺癌:一项国际汇总分析。致癌作用。2014;35:1267 - 1275。
de Villiers EM，等。乳头瘤病毒序列存在于乳头湿疣病变和乳腺浸润性癌。乳腺癌决议2005;7:1-11。
Lawson JS，等。人类乳头状瘤病毒和乳腺癌FrontOncol。2015.
劳森j.s.等。既往伴宫颈瘤变的乳腺癌患者的人乳头瘤病毒鉴定。FrontOncol。2016.
Volgareva GM，等。HPV在尿路上皮癌发生中的作用:问题的现状。膀胱癌——机器人手术的基础科学，2011。
hpv相关膀胱癌的细胞分化丧失。BullExpBiolMed.2016; 161:96 - 98。