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P - ISSN: 2347 - 2286
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Lyudmyla g . Glushakova1,巴里·w·中音2,安德里亚·布拉德利1和Steven a . Benner1*
1火鸟生物分子科学有限责任公司,13709年进步大马路,框17日Alachua,高度层32615,美国
2佛罗里达医学昆虫学实验室,佛罗里达大学,9日街200号,维罗海滩,高度层32962,美国
收到日期:07/08/2018;接受日期:20/08/2018;发表日期:28/08/2018
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22倍多路复用Luminex面板检测医学上重要的虫媒病毒以前报道针对小分子rna产生在体外。两个合成生物学创新使这种级别的复用成为可能。我们问多路复用是健壮的九个目标时添加的黄,Togaviridae和病毒之一家庭。试验敏感性是10,80年和270年genome-equivalents加利福尼亚脑炎,基孔肯亚病和穆雷谷脑炎病毒,说明多路复用使用这些创新的鲁棒性。大量的这些病毒在一个单一的感染蚊子通常更高。此外,专家组确定穆雷谷脑炎病毒在一个蚊虫汇集(5-50)未受感染的蚊子。
多路复用xMAP Luminex DHA;蚊媒虫媒病毒;合成生物学
全球化广泛和日益增长的对人类的影响1]。个人旅行,群体迁移,产品装运,和其他活动创建一个bio-dynamic全球过程,植物、动物、微生物等生物从地区其他地区的原住民,他们可能不被认可2]。结合其他趋势,包括人口的增长,农业多样性和城市化,这个过程会导致危险的传染病的出现在新的地方3]。
这说明与虫媒病毒,从本国的位置扩大到新的世界各地,通过昆虫的地理扩张,尤其是国内蚊子4- - - - - -7]或感染的主机已经存在(例如,人类侵占野生栖息地和旅途感染)。因此,诊断工具在北美现在必须目标不是北美特有的蚊子传播的虫媒病毒。
多路复用试验平台启用同步检测核酸(NA)从大量的病原体,土著而不是土著。多路复用减少了时间,人力成本和其他成本相对传统singleplexed化验。原则上,多放映场影剧院,可以检测非病原体核酸可提醒卫生保健提供者的一个新兴的病原体的存在。
最近[8),我们开发了一个基于PCR的xMAP Luminex杂交平台目标22蚊子传播的虫媒病毒。面板是有效的探测火成岩和不是土著北美医学上重要的病毒黄(属黄病毒),Togaviridae(属甲病毒)和病毒之一(属Orthobunyavirus)家庭(表1)。
| 家庭/属 | 病毒和缩写 | 应变/隔离 | 加入基因库 | 效价、日志空斑形成单位/毫升 | 效价、空斑形成单位/毫升 |
|---|---|---|---|---|---|
| 黄/黄病毒第四组,积极ssRNA | 日本脑炎(JEV) | 中山 | EF571853 | 8.00 | 1 x 108 |
| 黄热病(YFV) | Asibi | AY640589.1 | 7.66 | 4.57 x 107 | |
| 穆雷谷脑炎(MVEV) | MVE-1-51 | AF161266.1 | 7.43 | 2.69 x 107 | |
| Togaviridae /甲病毒第四组,积极ssRNA | 基孔肯亚病* (CHIKV) | 英属维尔京群岛(2013)、英属维尔京群岛、亚洲血统 | KJ451624 | 2.42 x 1010基因组/毫升 | |
| LR2006-OPY1 (LaReunion, 2006) | KT449801 | 1.89 X 108基因组/毫升 | |||
| 病毒之一/Orthobunyavirus集团V - ssRNA | 加利福尼亚脑炎(CEV) | BFS 283 | 段:KX817314.1 M: KX817313.1 L: KX817312.1 | 8.43 | 2.69 x 108 |
| 詹姆斯敦峡谷(JCV) | 61年v2235 | 段:KX817317.1 M: KX817316.1 L: KX817315.1 | 8.28 | 1.9 x 108 | |
| 拉克罗斯脑炎(LACV) | 原始的威斯康辛州病毒(LACV /人类/ 1960) | 段:EF485030.1 M: EF485031.1 L: EF485032.1 | 7所示。64年 | 4.37 x 107 | |
| 梯形(KSV) | b64 - 5587.05 | 段:KX817323.1 M: KX817322.1 L: KX817321.1 | 9.26 | 1.82 x 109 | |
| 北美野兔(SSHV) | 原始 | 段:EU294510.1 M: K02539.1 L: EU203678.2 | 8.57 | 3.72 x 108 | |
表1:虫媒病毒。所有的病毒都来自疾病控制和预防中心(CDC)。*浓度估计的实时rt - pcr (TaqMan)。
获得如此高的多路复用,平台开发两个新形式的DNA。一,“人为地扩大了遗传信息系统”(AEGIS)核苷酸不补充天然核苷酸(9];在这里,宙斯盾核苷酸是“Z”和“P”,形成一个正交Z: P。AEGIS引物不能杂交任何自然DNA,无论多么复杂。第二,“自已避免分子识别系统”(samr),核苷酸,不能相互绑定(10]。因此,samr引物不能相互作用形成引物二聚体。
“嵌套”架构,互补脱氧核糖核酸合成与嵌合有针对性的发起引物。嵌合引物有宙斯盾核苷酸的5 '端,而他们有针对性的片段包含samr核苷酸的3 '端。这允许嵌合体(0.03μM)启动逆转录(RT)与samr防止引物二聚体的形成。一旦启动,常见的正向和反向外部包含宙斯盾核苷酸引物(0.3μM) ~周期进行聚合酶链反应(图1)。他们的支持组件确保没有PCR资源被浪费的脱靶绑定外部引物。
对Luminex杂交检测平台,引入宙斯盾dZ扩增子的一个名叫“音译”过程。这里,reverse-primer扩展反应(rp)利用一些聚合酶的能力匹配宙斯盾dZ oppositetemplatedG。结果GAZT序列捕获在Luminex微球探针包含宙斯盾dP dZ相反。这个配对大大增加病原体检测的敏感性的Luminex xMAP化验(9]。rp还喜欢单链的积累(ss)生物素化的扩增子并促进下游Luminex杂交。提出了分析概述图1一个改编自前一个出版(8]。
图1:改编自(8经允许)。概述的Luminex xMAP Luminex直接杂交平台开发检测22医学上重要的蚊子传播的虫媒病毒。
诊断小组最初使用小RNA片段(病毒模拟的)开发生产体外。验证,然而,随着登革热血清型1到4个完整的病毒基因组。分析(20μL)决议6 - 10 dengue1 genomes-equivalents (DENV1)。它可以检测dengue1病毒RNA在一个受感染的埃及伊蚊在混合样品(25)未受同行的8]。
在这里,我们报告的扩展试验验证包括其他完整的病毒基因组从三个病毒的家庭相当医学上重要的代表(表1)。来自加州的病毒血清组(加利福尼亚脑炎,君越脑炎,詹姆斯敦峡谷,梯形,和北美野兔病毒缩写为CEV LACV, JCV、KSV SSHV,分别病毒之一)是流行在北美和已知病因的代理人神经感染性疾病在人类和牲畜11,12]。基孔肯雅病毒(CHIKVTogaviridae家庭)是一个新兴的病原体,扩大了自然边界和入侵美洲(13,14在人口[],导致严重的健康问题15]。乙型脑炎病毒(JEV),黄在亚洲)脑炎的主要原因,每年约有67900例(20%,病死率-30%和神经或精神的后果在30% - -50%的幸存者)(16]。穆雷谷脑炎(MVEV黄)是澳大利亚最重要的流行虫媒病毒传播。它造成严重脑炎暴发的澳大利亚东南部在1900年代(17,18]。
每个试验进行了纯化病毒RNA(约1/100的病毒股票,表1)建立了协议后8]。所有化验显示清晰,针对性的Luminex荧光信号,在3000 - 9000年平均荧光强度(MFI)单位(50至150 /背景,图1 b)。唯一的交叉反应是观察SSHV和CE病毒:积极信号从CVE注册目标是大约50%的一个特定SSHV信号。这是预期这两个病毒密切相关(11]。面板检测极限(LOD)定义使用连续稀释的病毒RNA测试每个家庭的代表。专家组发现ca。10日,80年和270年基因组CVE的等价物,分别CHIKV和MVEV。这些病毒在受感染的蚊子的副本的数量通常是大大高于这些钟表。增加rp周期数字(20 - 35)通常导致检测灵敏度。
图1 b:虫媒病毒的检测黄病毒,病毒之一和Togaviridae家庭。每一个小组提出了22倍多路复用分析单个病毒RNA。中间面板,珠子身份,礼物Luminex微球退火目标——具体包含宙斯盾dPTP核苷酸探针。samr核苷酸;自已避免分子识别系统;AEGIS核苷酸;人为地扩大了遗传信息系统;dZTP (Z);dPTP (P);AEGIS核苷酸; MFI: Median Fluorescence Intensity (Luminex unit); PFU: Plaque Forming Unit (viral titer); NA: Nucleic acids; LOD: Level of Detection.
此外,我们测试的能力分析来检测MVEV在受感染的蚊子。没有背景从蚊子NA。然而,MVEV可以检测到在一个受感染的蚊子汇集在49个未受感染的蚊子。
因此,这里给出的诊断小组可能是一个有用的工具为蚊子监测和监督,同时,高通量检测病原体在临床样本。
研究报告在这份出版物是43 gm114967 NIH SBIR的支持。内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。我们感谢布拉德利Eastmond和基南•威金斯援助虫媒病毒的传播。本研究中使用的虫媒病毒请由疾病控制与预防中心提供。
一些本文作者和他们的机构的与试验相关的知识产权,包括samr、庇护,音译/捕获技术。此处提到的试剂销售的火鸟生物分子科学、LLC拥有SAB表示作者和拥有。
