部门医学生物学Necmettin尔巴坎大学Selcuklu /科尼亚,土耳其
收到的日期:28/07/2017;接受日期:08/08/2017;发布日期:15/08/2017
访问更多的相关文章报道在癌症和治疗
Myc致癌基因是导致癌症的发展,和许多的基因变得活跃。研究这些基因的表达导致开发新的治疗癌症患者的治疗。这种情况很快就被发现,或生物标志物Myc表达式先驱mitogenindependent触发细胞的分化和增殖,特别是。Myc激活是编码序列的突变的结果。突变年代的编码序列中观察到4 50白血病标本。四个突变命名SNP (rs3134614、rs1800834 rs61731506, rs74067837),外显子2的突变。DNA测序表明A、G、C、T L-myc基因外显子2的形成。任何改变已经确定外显子1。一个点突变或单点突变叫SNP包含一个不正确的碱基配对。此外,看看L-Myc有急性白血病的点突变,或急性白血病患者存在L-Myc基因的点突变分析基因序列测定和聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)测定。在这项研究中,观察到的突变对白血病患者已经被证明是最常见的一种L-Myc突变,与文献一致。之间有显著差异的基因型分布白血病患者观察和控制。我们的研究结果表明L-Myc基因多态性是一个合适的预后标记识别的转移性增长慢性淋巴细胞白血病(CLL)和土耳其人群的急性成髓细胞的白血病(AML)。
L-myc基因,基因序列,SNP或突变
白血病是一种恶性疾病(癌症)的骨髓和血液。根据白血病细胞的类型分为四类。这些都是急性或慢性粒细胞性和急性或慢性淋巴细胞白血病。细胞生长与增殖以及相关联控制短生存或增殖异常/不受控制的细胞DNA。因此,有恶性肿瘤或正常细胞或细胞的形状。它决定了细胞的命运突变在细胞的DNA (1- - - - - -7]。在白血病的情况下观察到不受控制的淋巴细胞在骨髓细胞的数量增加会导致血液中淋巴细胞的数量的增加在同一时间。积累的白血病细胞在慢性淋巴细胞白血病骨髓不会阻止正常的血细胞生产一样深刻的急性淋巴细胞白血病。这一重要区别急性白血病占早期不太严重的疾病。myc原癌基因调节细胞增殖和分化相关的DNA来源磷蛋白质编码的核心部分。Myc基因自然主要扮演着积极的角色在造血疾病如白血病和淋巴瘤。研究近年来,myc基因家族从N-myc L-myc基因可以导致正常和恶性造血作用也证明了(7- - - - - -11]。L-Myc基因首先被发现与原癌基因结构相似和N-Myc小细胞肺癌细胞系。L-Myc基因最初被确定为一个基因结构smilarity原癌基因和N-Myc从人类小细胞肺癌行(12- - - - - -16]。L-Myc是致癌基因局部染色体1意思是通过激活肿瘤生长期间(17- - - - - -23]。L-Myc由基因和作为转录因子编码这些特定的分子或蛋白质核磷蛋白调节细胞扩散和分化。
除了在个人和早期发现癌症经胎盘的治疗癌症识别易感性基因突变或多态性决定lmyc是很重要的。因此lmyc致癌基因在土耳其人口在这个研究调查是否生物标志物。细胞的研究表明,蛋白质分子的n端myc导致点突变导致了不受控制的细胞增殖,从而抑制细胞凋亡显示,观察肿瘤的生长。因此,白血病癌症已被归因于许多基因异常,包括突变/肿瘤抑制基因的缺失,存在多个自分泌生长周期,细胞的增殖和转录放松管制。SSCP非常高功率检测突变单链DNA片段的电泳技术。SSCP分析基于能力的一个(或更多)来检测突变和多态性的DNA是一种常用的技术。单链DNA分子不变性条件下,根据不断变化的环境中定义的电泳淌度是(20.]。SSCP分析在这项研究中,PCR产品放射性同位素被用来标记荧光染料,然后然后被阅读毛细管电泳的结果。在这种情况下,允许不同的峰值或乐队的形成的杂合的状态。对于大多数的基因位点这Tris-formiate /硼酸缓冲系统提供足够的歧视,发现大部分的突变。重要的一点,反应的温度应该为每一个基因位点进行优化。
本研究的目的是定义L-Myc突变在白血病发病机制中的作用的土耳其人也强调,这些基因可以作为生物标志物。在目前的研究中,我们分析了L-Myc突变在50个白血病患者土耳其的可能性。我们因此anayzed 4病人的单链DNA,以确定突变的存在构象多态性或SSCP之后激活细胞间信号通路基因的突变,包括PTHC、识别DNA序列分析了。我们测量的频率L-Myc多态性,相结合,确定4小说基本变化。为了说明这些技术的适用性筛选DNA突变和多态性,后来,SSCP识别最好的L-Myc突变也遭受过测序反应顺序测试。简单地说,在这项研究中所有方法研究了三次。
病人
白血病患者外周血样本收集来自50个。急性白血病的诊断是基于形态学和细胞化学的标准Selcuk大学医学院、血液学、科尼亚,土耳其。详细的病史,体格检查和病理诊断对所有患者进行研究。共有50个病人和50名健康血液样本主要得到的病理学,血液学Selcuk大学医疗中心,土耳其。
基因组DNA的隔离
外周血基因组DNA提取的50个白血病患者和50正常志愿者控制通过使用自动EZ1自动DNA孤立系统(试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国)与DNA试剂盒隔离设备。提取后,absorbans比DNA (A260 / A280)是由日本岛津公司uv - 1700分光光度计记录控制从血液中提取的DNA的纯度和数量(图1)。
图1:基因组DNA isolaled从白血病患者和控制健康血液标本,分别与BioRobot巷1,2,3 - EZ1。DNA样本提交在1%琼脂糖凝胶电泳。
聚合酶链反应(PCR)扩增L-Myc Exon1
模板DNA(0.5 - -1.0μg)是在无菌条件下用于PCR。100 ng的底漆用于反应。PCR进行使用100 ng从外周白细胞中提取的基因组DNA和特定的引物对:
正向引物5 -AGTTCACTCACAGGCCACAT-3和反向引物,5“-TGCATATCAGGAAGCTTGAG-3”被用作引物(1毫米)25μl PCR混合包含10毫米Tris-HCl (pH值8.3),50 mM氯化钾,50 mM MgCl2,核苷酸(dGTP、dATP dTTP, dCTP)在0、5毫米每1 U(聚合酶。放大是使用一个自动执行thermocycler (BioRad)与初始变性步骤在94°C 60秒,紧随其后的是30个周期(94°C,持续30秒,50°C 1分钟,1分钟和74°C)。PCR在2%琼脂糖凝胶电泳分离的产品解决方案含有溴化乙锭和紫外线transsimilator成像。后来,PCR扩增267个基点产品直接与限制性内切酶消化EcoRI (Fermentas)。
遗传标记
单核苷酸多态性的一项初步研究中50选择土耳其白血病患者使用PCR扩增和核苷酸序列的比较。PCR引物设计放大267个基点DNA片段覆盖整个编码区和非编码序列的2.8 kb L-Myc(加入基因库M19720)。DNA样本被放大在最后一个反应体积25毫升含有50 ng基因组DNA的核苷酸100毫米,1.5毫米MgCl21 U AmpliTaq黄金聚合酶(Fermentase)和10 pmol每个特定的引物。35 PCR循环,每个在95°C组成的15秒,10秒58°C和20秒在72°C, GeneAmp PCR体系中进行了9700年。整除PCR产品装载在溴化乙锭染色琼脂糖凝胶,检查质量的PCR扩增(图2)。核苷酸序列使用ABI棱镜310自动测序仪(珀金埃尔默),对齐和比较确定单核苷酸多态性。
图2:直接可视化的PCR产物溴化乙锭染色。267个基点L-Myc片段被放大,在2%琼脂糖凝胶电泳。巷1、50个基点阶梯大小的标准。巷2 - 5、PCR产物的白血病患者和6巷,PCR产品健康的人。
SSCP L-Myc致癌基因的突变分析
白血病患者放大的DNA样本使用PCR SSCP分析L-Myc基因。突变分析L-Myc exons1 5个样本进行了使用聚合酶链反应(PCR)引物绑定到intronic每个外显子序列侧翼。PCR产品每个外显子的突变筛查的单链构象多态性(SSCP)或heteroduplex分析。放大后,10毫升的PCR产品与20毫升混合加载缓冲区(95%的甲酰胺,20毫米EDTA, 0.05%二甲苯苯胺和溴酚蓝),10分钟变性在95°C,扑灭在冰上。SSCP分析,热变性后PCR产品受到nondenaturating聚丙烯酰胺凝胶电泳。SSCP或heteroduplex乐队模式的患者和正常的血液被银染色的凝胶可视化(图3)。
图3:单链构象多态性based-polymerase L-Myc基因的连锁反应(SSCP)分析,分别巷1,50个基点阶梯尺寸标准,和巷2 - 5,流动性变化由于PCR产物突变的白血病患者,6巷、PCR产品健康的人使用的控制。
DNA序列
在这项研究中,一旦定义在PCR SSCP heteroduplex分析纯产品的例子自动DNA序列分析仪器与分析使用ABI棱镜310 DNA直接测序。纯化PCR SSCP分析产品的样品显示流动转变和随机选择的样本用于直接使用自动DNA测序器ABI棱镜310 DNA测序。使用引物PCR正向和反向序列发生减少工件是由至少两次进行PCR和优化PCR产品准备的反应。然后基于荧光标记的应用生物系统公司是由序列分析。纯化单链扩展产品然后解决ABI 310棱镜或DNA测序仪(图4和5)。
图4:序列白血病癌症患者的心电图显示L-Myc基因外显子2的突变杂合子序列。
图5:一般筛选突变位点在L-Myc白血病患者的基因序列从土耳其人口。
统计分析
根据统计分析的结果,社会科学软件包(SPSS)使用10.0版本。费舍尔然后基因变化之间的病人和严格的测试是用于十几个人没有发现进行评估并与临床和病理参数。临床的发展之间的关系转移/复发和血清分子标记的存在也评估了双边皮尔逊2测试。的概率小于0.05被认为是具有统计学意义。
大多数类型的癌症细胞DNA的突变被发现和重大表示基因的基因组变异发生在定义的区域由结果和他们的条件是修改后的分子和生化指标。突变,扮演着重要的角色在癌细胞非常多样化的发展。尤其是反演除了在白血病细胞增殖异常和最常见的染色体易位或异常和这些变异,表明重大白血病克隆的形成。人类癌症,一些致癌基因显示各种异常,如点突变(8]放大[10],重排[10,12[],超9,12]。其中,Myc基因家族的异常(原癌基因、N-myc L-myc)基因扩增,经常被发现在各种癌症组织和细胞系如白血病(6,8,18),和结肠癌症13,胃15,21],乳腺癌[14,16)、肺(17]。myc基因家族的原癌基因的控制起着重要的作用在细胞增殖、分化、凋亡,myc基因表达中观察到的异常情况是很常见的在人类癌症19,20.,24,25]。分析了多态L-Myc基因位点PCR-RFLP在50个病人和50名健康人。结合体的三个基因型会出现267个基点,LS杂合子与267、140和120个基点,党卫军纯合子与140年和120年英国石油碎片。在这项研究中,我们已经确定了L-Myc突变的疾病阶段,没有关系,也在文章中,分别;我们分析了100个人健康献血者和患者招募。一本研究的目的是探讨频率识别多态性在L-myc土耳其人也变异识别技术规范SSCP技术。之间没有统计上的显著差异对于L-Myc各种类型的白血病基因多态性。突变检测的4 50白血病标本。四个突变命名SNP或rs3134614, rs1800834, rs61731506, rs74067837,外显子2的突变。DNA测序表明A、G、C、T发生L-Myc基因外显子2的。 Any change has been determined at exon 1. Namely, Exon 1 did not show any mutation, regardless of the presence or absence of loss of heterozygosity. In addition to, we used the same time as the molecular genetic techniques to determine whether point mutations in L-Myc gene are involved acute leukemias the PCR-based Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) techniques. Later, we analyzed by the gene sequence assay and Polymerase Chain Reaction-based Single-Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) assay. Single nucleotide polymorphism (SNP) markers being the most common polymorphism observed in a genome. Another objective of this study were to discover SNPs in gene sequence and determination of L-myc gene mutation and polymorphism in patients with leukemia by comparing sequences from coding and noncoding regions obtained from the GenBank and genomic DNA and to compare sequencing results with those obtained using single base extension assays. Single nucleotide polymorphisms in coding regions may have functional significance if the resulting amino acid change causes altered phenotype. All leukemias and their normal healthy specimens were screened for the mutations of the L-Myc oncogene in two exons using PCR-SSCP analysis and of those patients; four cases were detected in exon 2 and SNP sites (rs3134614, rs1800834, rs61731506, rs74067837) in exon 2 mutations. DNA sequencing reveals that A, G, C, and T occurred in exon 2 of the L-myc gene(图4和5)。在这项研究中,我们分析了100个人健康献血者和患者招募。然而,我们发现了一个统计上的显著差异在等位基因频率在良性和恶性患者情况。没有先前的研究必须众所周知,突变的基因参与控制细胞的生长和/或differentation如原癌基因影响白血病的发展(3,5]。病人的频率高出10省人口的研究中,以及在其他癌症的团体,这是符合性别分布通常观察到这种类型的癌症(11]。SSCP技术已被证明是有用的和经济的一系列突变和多态性检测基因(4,17,18),尽管这项技术的使用是有限的。检测单基地替换在较大的DNA片段(太敏感24),它可能是有利的选择其他引物配对或消化大片段生成DNA分子柯林斯et al(定义的最佳规模4)为150个基点。总之SSCP已成功用于定位在L-Myc序列变异。许多不同的突变的发现排除了使用突变分析产前诊断,但进一步调查的多态性标记为此可能会有用。最近的一项研究表明,MYC基因的点突变灭活细胞凋亡活动,导致了肿瘤的转换。MYC基因的点突变是否参与癌症,我们分析了n端集群区域的突变与急性白血病50例,通过聚合酶链反应单链构象多态性分析。总结说,没有在不同的癌症MYC基因的体细胞突变。
数据显示,MYC基因点突变的n端结构域可能是非常罕见的人类癌症一样,虽然观察MYC基因的点突变的存在被发现导致癌症。
我们研究了50个白血病病人和50名健康对照组的土耳其裔L-Myc基因多态性。出于这个原因,我们研究确定L-Myc基因多态性的分布在土耳其白血病患者癌症的DNA和优化隔离从病人和健康的血液样本,并使用PCR扩增L-Myc基因位点。此外,它是观察到的外显子2的突变基因和是否重要L-Myc标记在白血病患者中,我们分析了50个白血病标本。突变检测的4 50白血病标本。四个突变命名SNP (rs3134614、rs1800834 rs61731506, rs74067837),外显子2的突变。DNA测序表明A、G、C、T发生L-myc基因外显子2的。任何改变已经确定外显子1。即外显子1没有显示任何突变,无论存在与否的杂合性丢失。点突变或SNP(单核苷酸多态性也在复制过程中出现错误的碱基配对。除了,我们使用一个分子基因分型方法是否涉及L-Myc急性白血病的点突变,我们分析了基因序列测定和聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)测定。 The frequency of mutations was higher in the regions of the gene and missense mutations was regarded as the most common type of mutations causing severe leukemia and this conclusion was in accordance with the literature. Our results suggested that L-Myc gene polymorphism was a suitable prognostic marker of metastatic development in Turkish chronic lymphocytic leukemia (CLL) and acute myeloblastic leukemia (AML).
这项研究部分由Selcuk大学Archeometry Selcuk大学的生物技术实验室和科学研究基金会(BAP)提供基础。
菜单