部门医学生物学， Necmettin Erbakan大学，Selçuklu/土耳其科尼亚
收到的日期: 28/07/2017;接受日期:08/08/2017;发布日期: 15/08/2017
更多相关文章请访问《癌症与治疗》报告
Myc致癌基因有助于癌症的发展，许多基因变得活跃。对这些基因表达的研究导致了治疗癌症患者的新疗法的发展。这种情况很快被发现，一个先驱或生物标志物Myc的表达触发细胞的分化和增殖作为丝裂原无关，特别是。Myc激活是编码序列突变的结果。突变50例白血病标本中有4例检测到S编码序列。外显子2突变中的四个突变被命名为SNP (rs3134614, rs1800834, rs61731506, rs74067837)。DNA测序显示，A、G、C和T形成于L-myc基因的外显子2。任何变化都是在外显子1上确定的。被称为SNP的点突变或单点突变包含不正确的碱基配对。此外，观察L-Myc点突变是否存在急性白血病，或急性白血病患者存在L-Myc基因点突变，我们通过基因序列测定和基于聚合酶链反应的单链构象多态性(PCR-SSCP)分析。在这项研究中，在白血病患者中观察到的突变已被证明是最常见的L-Myc突变类型，与文献一致。白血病患者与对照组的基因型分布有显著差异。我们的结果表明，L-Myc基因多态性是土耳其人群转移性生长慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性髓细胞白血病(AML)的合适预后标志物。
L-myc基因，基因序列，SNP或突变
白血病是骨髓和血液的恶性疾病(癌症)。白血病细胞按类型分为四类。这些是急性或慢性骨髓性白血病和急性或慢性淋巴细胞白血病。细胞的生长，与增殖、受控的短期存活或异常/不受控制的细胞DNA的增殖有关。据此，有恶性或正常细胞或细胞形状。它决定了任何细胞的命运突变在细胞的DNA中[1-7]。在白血病病例中，骨髓中淋巴细胞数量不受控制地增加，同时导致血液中淋巴细胞数量的增加。慢性淋巴细胞白血病中在骨髓中积累的白血病细胞不像急性淋巴细胞白血病那样严重地阻止正常血细胞的产生。这种与急性白血病的重要区别是该病早期病程较轻的原因。myc原癌基因调节细胞增殖和分化依赖于DNA起源的磷酸化蛋白，由核心部分编码。Myc基因自然主要在白血病、白血病等造血疾病中发挥积极作用淋巴瘤。近年来的研究表明，myc基因家族由N-myc和L-myc基因可引起正常和恶性造血作用也证明了[7-11]。L-Myc基因首次在小细胞肺细胞系中被发现与C-Myc、N-Myc具有结构相似性。L-Myc基因最初从人类小细胞肺癌系中被鉴定为与c-myc和N-Myc具有结构相似的基因[12-16]。L-Myc是一种定位于染色体1p34的癌基因，在肿瘤生长过程中被激活[17-23]。L-Myc由基因编码，作为一种转录因子，这些特定的分子或蛋白质由核磷蛋白调节细胞扩散和分化。
除了早期发现癌症的个体和经胎盘的治疗识别易感性癌症基因突变或多态性决定其lmyc是重要的。因此，本研究对土耳其人群中lmyc致癌基因是否具有一定的研究价值生物标志物。对细胞的研究表明，myc n端蛋白引起点突变，导致细胞不受控制地增殖，从而抑制细胞凋亡，可见肿瘤生长。因此，白血病癌被认为与多种基因异常有关，包括抑癌基因的突变/缺失、多个自分泌生长周期的存在、细胞增殖和转录失序等。与电泳技术相比，SSCP具有很高的检测单链DNA片段突变的能力。基于检测DNA突变或多态性的能力对一个(或多个)进行SSCP分析是一种常用的技术。未变性的单链DNA分子，电泳迁移率是根据环境变化来定义的[20.]。在本研究的SSCP分析中，用PCR产物放射性同位素标记非荧光染料，然后用毛细管电泳解读结果。在这种情况下，允许形成不同峰或带型的杂合子状态。对于大多数基因位点，这种tris -甲酸盐/硼酸盐缓冲系统提供了足够的识别能力，以检测大多数突变。重点是，反应温度应针对每个基因位点进行优化。
本研究的目的是确定L-Myc突变在土耳其人群白血病发病机制中的作用，并强调并可作为这些基因的生物标志物。在本研究中，我们分析了50例土耳其白血病患者L-Myc突变的可能性。因此，我们分析了4例患者的单链DNA，以确定是否存在构象多态性或SSCP遵循激活细胞间信号通路基因(包括PTHC)的突变DNA序列进行分析。我们测量了单独的L-Myc多态性的频率和组合，并确定了4个新的碱基变化。为了说明这些技术在DNA突变或多态性筛选上的适用性，随后，还对SSCP鉴定出的最佳L-Myc突变进行了测序反应，先后进行了测试。简而言之，本研究对所有方法进行了三次研究。
病人
采集50例白血病患者外周血标本。急性白血病的诊断基于土耳其科尼亚市塞尔丘克大学医学院血液系的形态学和细胞化学标准。对所有患者均进行详细的病史、体格检查和病理诊断。共有50名患者和50份健康血液样本主要来自土耳其塞尔丘克大学医学中心病理和血液学系。
基因组DNA分离
采用全自动EZ1自动DNA分离系统(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)和QIAGEN DNA分离试剂盒，从50例白血病患者和50例正常志愿者外周血中提取基因组DNA。提取后，用岛津UV-1700分光光度计记录DNA的吸收比(A260/A280)，以控制血液DNA的提取量和纯度(图1)。
图1:用BioRobot EZ1软件分别从白血病患者和对照健康血液标本Lane 1,2,3 -20中分离基因组DNA。DNA样本在1%琼脂糖凝胶中进行电泳。
聚合酶链反应(PCR)扩增L-Myc外显子1
模板DNA (0.5 ~ 1.0 μg)在无菌条件下进行PCR。反应使用100 ng引物。使用从外周血白细胞提取的100 ng基因组DNA和特定引物对进行PCR:
以正向引物5 ' -AGTTCACTCACAGGCCACAT-3 '和反向引物5 ' -TGCATATCAGGAAGCTTGAG-3 '为引物(每引物1 mM)，在25 μl PCR混合物中，分别含有10 mM Tris-HCl (pH 8.3)、50 mM KCl、50 mM MgCl2、0、5 mM dNTPs (dGTP、dATP、dTTP、dCTP)和1u Taq聚合酶。使用自动热循环仪(BioRad)进行扩增，初始变性步骤为94°C 60秒，随后进行30次循环(94°C 30秒，50°C 1分钟，74°C 1分钟)。PCR产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖溶液中进行凝胶电泳分离，并在紫外转换器上成像。扩增后的267 bp PCR产物直接用EcoRI (Fermentas)酶切。
遗传标记
通过PCR扩增和核苷酸序列比较，在50名土耳其白血病患者的初步研究中鉴定出了snp。设计PCR引物扩增覆盖L-Myc整个编码区和2.8 kb非编码序列的267 bp DNA片段(Genbank登录号M19720)。最终反应体积为25 ml，包含50 ng基因组DNA, 100 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl2， 1u AmpliTaq金聚合酶(发酵酶)和每个特定引物10 pmol。在GeneAmp PCR System 9700中进行了35个PCR循环，每个循环在95°C下为15秒，58°C下为10秒，72°C下为20秒。将等份PCR产物装载在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上，以检查PCR扩增的质量(图2)。使用ABI PRISM 310自动测序仪(Perkin- Elmer)对核苷酸进行测序，并进行比对以识别snp。
图2:溴化乙锭染色直接显示PCR产物。扩增出267 bp的L-Myc片段，并在2%琼脂糖凝胶上电泳。1道，50 bp阶梯尺寸标准。2-5 Lane是白血病患者PCR产物，6 Lane是健康人PCR产物。
L-Myc癌基因突变的SSCP分析
采用PCR扩增白血病患者DNA样本，对L-Myc基因进行SSCP分析。使用聚合酶链式反应(PCR)引物结合到每个外显子侧面的内含子序列，对外显子1到5个样本进行L-Myc突变分析。采用单链构象多态性(SSCP)或异质双工分析对每个外显子的PCR产物进行突变筛选。扩增后10 ml PCR产物与20 ml负载缓冲液(95%甲酰胺、20 mM EDTA、0.05%二甲苯氰醇、溴酚蓝)混合，95℃变性10 min，冰淬。为了进行SSCP分析，热变性后的PCR产物在不变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。通过凝胶银染色观察患者和正常血液的SSCP或异双相带模式(图3)。
图3:基于单链构像多态性的聚合酶链反应(SSCP)分析L-Myc基因，分别以白血病患者PCR产物中1、50 bp阶梯尺寸标准和2-5、因突变而迁移的lane，健康人PCR产物中6 lane作为对照。
DNA序列
在本研究中，一旦在SSCP中定义PCR产物的异质双工分析纯实例的自动DNA序列分析仪，分析使用ABI PRISM 310 DNA测序直接进行。采用ABI PRISM 310自动DNA测序仪对SSCP分析中显示迁移率变化的样品和随机选择的样品进行直接DNA测序。采用引物进行PCR正向和反向序列，以减少伪影，至少进行两次PCR，优化的PCR产物已准备反应。然后对基于荧光标记的Applied Biosystems进行序列分析。纯化后的单链延伸产物在ABI PRISM 310或DNA测序仪上进行解析(图4及5)。
图4:2外显子L-Myc基因突变杂合子序列的白血病患者序列电图
图5:土耳其人群白血病患者L-Myc基因序列突变位点的一般筛查。
统计分析
根据统计分析结果，采用社会科学10.0软件包(SPSS)版本。对未发现的非疾病个体进行Fisher检验，评估患者与非疾病个体的基因变化，并与临床和病理参数进行比较。临床转移/复发的发展与血清分子标记物的存在之间的关系也通过双面Pearson 2检验进行评估。小于0.05的概率被认为有统计学意义。
大多数类型的癌细胞突变是在DNA中发现的，显著的基因组变异发生在所述基因组成结果的定义区域，其条件是经过修饰的分子和生化分析。在癌细胞发展中起重要作用的突变是非常多样化的。特别是反转除白血病中细胞增殖异常外，最常见的还有染色体易位或异常和这些突变，提示白血病克隆形成显著性。人类癌症，一些癌基因表现出各种异常，如点突变[8放大[10]，重排[10，12]，以及过度表达[9，12]。其中，Myc基因家族(c-myc, N-myc, L-myc)基因扩增异常，在白血病等多种癌症组织和细胞系中经常被检测到[6，8，18]，以及结肠癌[13]，胃[15，21]，乳房[14，16]和lung [17]。myc基因家族中的c-myc在控制细胞增殖、分化和凋亡中起着重要作用，异常情况下观察到的myc基因表达在人类癌症中非常常见[19，20.，24，25]。采用PCR-RFLP对50例患者和50例健康人的L-Myc基因多态性位点进行分析。这3种基因型分别为267 bp的LL纯合子，267、140和120 bp的LS杂合子和140和120 bp片段的SS纯合子。在这项研究中，我们已经确定了L-Myc突变和疾病阶段之间没有关系，也分别在文章中;我们分析了从健康献血者和患者中招募的100名个体。本研究的目的之一是调查频率，以确定土耳其人L-myc的多态性，以及一种突变识别技术，以标准化SSCP技术。不同类型白血病L-Myc基因多态性差异无统计学意义。50例白血病标本中有4例检测到突变。外显子2突变中的四个突变被命名为SNP或rs3134614, rs1800834, rs61731506, rs74067837。DNA测序显示，A、G、C、T出现在L-Myc基因的外显子2上。 Any change has been determined at exon 1. Namely, Exon 1 did not show any mutation, regardless of the presence or absence of loss of heterozygosity. In addition to, we used the same time as the molecular genetic techniques to determine whether point mutations in L-Myc gene are involved acute leukemias the PCR-based Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) techniques. Later, we analyzed by the gene sequence assay and Polymerase Chain Reaction-based Single-Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) assay. Single nucleotide polymorphism (SNP) markers being the most common polymorphism observed in a genome. Another objective of this study were to discover SNPs in gene sequence and determination of L-myc gene mutation and polymorphism in patients with leukemia by comparing sequences from coding and noncoding regions obtained from the GenBank and genomic DNA and to compare sequencing results with those obtained using single base extension assays. Single nucleotide polymorphisms in coding regions may have functional significance if the resulting amino acid change causes altered phenotype. All leukemias and their normal healthy specimens were screened for the mutations of the L-Myc oncogene in two exons using PCR-SSCP analysis and of those patients; four cases were detected in exon 2 and SNP sites (rs3134614, rs1800834, rs61731506, rs74067837) in exon 2 mutations. DNA sequencing reveals that A, G, C, and T occurred in exon 2 of the L-myc gene(图4及5)。在这项研究中，我们分析了从健康献血者和患者中招募的100名个体。然而，我们发现良性和恶性患者的等位基因频率有统计学意义上的差异。目前尚无相关研究，但已知参与控制细胞生长和/或分化的基因突变如c-myc会影响白血病的发展[3.，5]。在研究人群中，以及在其他癌症组中，患者的频率明显较高，这与通常在这类癌症中观察到的性别分布一致[11]。SSCP技术已被证明对检测基因中的一系列突变和多态性是有用和经济的。4，17，18，尽管这项技术的使用是有限的。在较大的DNA片段中，单碱基取代的检测不太敏感[24]，选择其他引物对或消化更大的片段以产生Collins等人定义的最佳大小的DNA分子可能是有利的[4]为150 bp。综上所述，SSCP已成功用于L-Myc序列变异的定位。许多不同突变的发现排除了突变分析用于产前诊断，但进一步研究多态性可能会产生有用的标记物。最近的一项研究表明，点突变抑制了MYC的凋亡活性，促进了肿瘤的转化。为了了解MYC的点突变是否与癌症有关，我们采用聚合酶链式反应单链构象多态性分析了50例急性白血病患者MYC突变的n端簇区。综上所述，MYC基因在不同的癌症中均未出现体细胞突变。
这些数据表明，MYC基因在n端结构域的点突变在常见的人类癌症中可能是非常罕见的，尽管在MYC基因中观察到的点突变的存在被确定为有助于癌症d。
我们研究了50名白血病患者和50名土耳其裔健康对照的L-Myc基因多态性。为此，我们研究了确定L-Myc基因多态性在土耳其白血病癌症患者中的分布，以及优化患者和健康血液样本的DNA分离和L-Myc基因位点的PCR扩增。此外，我们对50例白血病标本进行分析，观察白血病患者基因外显子2的突变及其是否是重要的L-Myc标记物。50例白血病标本中有4例检测到突变。外显子2突变中的四个突变被命名为SNP (rs3134614, rs1800834, rs61731506, rs74067837)。DNA测序显示，A、G、C和T出现在L-myc基因的外显子2上。任何变化都是在外显子1上确定的。即，无论是否存在杂合度缺失，外显子1均未出现突变。在复制过程中会发生点突变或SNP(单核苷酸多态性)，也就是不正确的碱基配对。此外，我们采用分子基因分型方法，通过基因序列测定和基于聚合酶链反应的单链构象多态性(PCR-SSCP)分析L-Myc的点突变是否与急性白血病有关。 The frequency of mutations was higher in the regions of the gene and missense mutations was regarded as the most common type of mutations causing severe leukemia and this conclusion was in accordance with the literature. Our results suggested that L-Myc gene polymorphism was a suitable prognostic marker of metastatic development in Turkish chronic lymphocytic leukemia (CLL) and acute myeloblastic leukemia (AML).
本研究得到塞尔丘克大学考古生物技术实验室和塞尔丘克大学科学研究基金会(BAP)的部分支持，为研究提供基础。
菜单