黄檀黄酮对大鼠脑缺血再灌注性脑梗死保护作用可能机制的研究

摘要

白檀通常被称为“bete和sitsal”。本实验通过对大鼠全脑缺血模型的研究，探讨了黄檀皮甲醇提取物的脑保护作用机制。实验动物给予DL预处理1周(500 mg/kg)，在闭塞性i.p前10分钟给予所有抑制剂。用硫喷妥酮钠(45mg/kg)麻醉动物，并在缝线的帮助下诱导双侧颈总动脉闭塞(BCCAO)梗死30分钟，用滑移结释放结。让动物再灌注48小时。然后动物被宰杀，大脑被斩首。进行超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、髓过氧化物酶、丙二醛生化检测和组织学检查。结果表明，黄檀提取物具有较强的脑保护作用，其机制可能与COX通路抑制剂协同作用。

关键字

脑缺血、脑卒中、双侧颈总动脉闭塞、脑梗死、氧化应激、类黄酮、抗氧化剂。

简介

中风是世界上导致死亡和残疾的主要原因之一。世卫组织估计，在1990年至2020年期间，全世界中风死亡率将增加，女性增加78%，男性增加106% [1］．中风是世界上第二大致死原因，每年造成约600万人死亡[2］．据估计，中风的终生风险在8%至10%之间[3.］．在发病方面，中风涉及一系列不同的过程。血管闭塞(缺血性中风)占所有中风的85%，而原发性脑内出血(出血性中风)占其余[4］．缺血性中风占所有中风的87%。在45至64岁的人群中，8%至12%的缺血性中风在30天内死亡[5］．

类黄酮具有高度活性的羟基，通过电子捐赠被氧化，从而将自由基稳定为活性较低的分子。其中一种反应方式是直接清除自由基，如超氧阴离子、单线态氧和脂质过氧自由基。在结构上，决定黄酮还原势的重要特征是羟基化模式、b环上的α 3,4 ' -二羟基儿茶酚结构、分子的平面性以及c环上2,3-不饱和与4-氧基的共轭。有相当多的证据表明，黄酮类化合物有效地减弱自由基和活性氧和活性氮(ROS/RNS)的有害影响。例如，槲皮素和一些结构相关的类黄酮在暴露于H₂O₂［6］．同样在PC12细胞中，添加黄酮类化合物或富含黄酮类化合物的提取物抑制了过氧化氢诱导的ROS增加，从而提高了细胞存活率[7,8］．

铃木等人。[9]在大脑中动脉闭塞(MCAO)和再灌注前5天和再灌注期间给大鼠饮用儿茶素提取物，以观察其对脑卒中后各种恶化过程的保护作用。儿茶素通过抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和中性粒细胞浸润，显著改善再灌注后观察到的神经功能缺损。此外，由于儿茶素具有强大的自由基清除特性，过氧亚硝酸盐的形成被发现减少。洪等人。[10]在沙鼠缺血前，在饮用水中随意加入绿茶提取物3周。这种治疗减少了梗死体积、凋亡细胞数量和脂质过氧化，并抑制了缺血诱导的过度活动。

Dalbergia latifolia是一种大型无毛树，只有一根茎，有一种特有的气味[11］．它分布在比哈尔邦，邦德尔坎德邦和印度中部[12］．它含有dalbinol，一种新的12α-羟基rotenoid [13]，籽中含有西葫芦素香豆素，β-谷甾醇，树皮中还含有达尔bergichromene、lupeol、latifolin和达尔berggin，心材中含有拉丁酮、类黄酮达尔criodon [14]和latinone，一种取代菲- 1,4 -醌从黄檀中分离得到[15］．其茎皮含有单宁，可用于治疗麻风病、肥胖和蠕虫[12］．乙酸乙酯(50%)树皮提取物对蛔虫具有致痉挛和驱虫活性[16］．作为乙醇药，茎皮含有单宁，可用于治疗麻风病和蠕虫[17］．许多种Dalbergia是重要的木材树种，因其装饰性和芳香的木材而有价值，富含芳香油[18,19］．传统上，各种品种被报道用于壮阳、堕胎、祛痰、解热、开胃、解渴、呕吐、烧灼感，治疗皮肤病、溃疡、血液病，减少肥胖，用于白癜风、消化不良、痢疾，用于眼鼻疾病、梅毒、胃病、麻风病、白癜风、疥疮和癣[20.］．

材料与方法

收集植物材料

Dalbergia latifolia的树皮部分于2012年6月从Tirupati森林中采集，由K.Madhava chetty鉴定和鉴定，凭证标本保存在班加罗尔卡纳塔克药学院药理学系。植物材料被彻底清洗，以清除附着的土壤、泥浆和碎片。树皮在室温下在阴凉处干燥至恒定质量。用搅拌器将植物材料粗磨成粉。粉末被储存在一个密封的容器中，避免光照。

提取物的制备

得到的植物材料用机械搅拌机进行研磨，得到粒度均匀的细粉。大约250克粉末在索氏装置中用甲醇处理2小时。将得到的液体提取物置于阴凉处进行蒸发，以除去多余的溶剂，从而形成药物提取物的固体块。计算萃取物的收率，并储存起来以备将来使用。进一步对固体甲醇药物提取物进行柱层析分离黄酮类化合物，通过黄酮类化合物化学测试确认药物中黄酮类化合物的存在，并采用吸附柱层析和薄层色谱对黄酮类化合物进行纯化。利用光谱数据来预测化合物的可能结构。

实验动物

实验选用白化雄性wistar大鼠，8-10周龄，体重250-280g。实验前驯化一周。将动物关在完全通风的笼子里，保持12:12 h的明暗循环，并在25±2°C的温度下饲养。他们可以免费获得标准的饮食和水。在动物身上进行的所有实验都符合实验动物使用的标准，实验规程也得到了机构动物伦理委员会的正式批准。

实验设计

将大鼠随机分为10组，每组6只。

•第1组:缺血再灌注(I/R)

•第2组:假手术(手术切口)

•第三组:车辆

•第4组:白檀(DL)

•第五组:L-NAME

•第六组:L-NAME + DL

•第七组:尼美舒利

•第八组:尼美舒利+DL

•第九组:别嘌呤醇

第10组:别嘌呤醇+ DL

脑缺血诱导

静脉注射硫喷妥酮钠(45 mg/kg)麻醉动物。闭塞:手术诱导脑缺血的方法采用早前发表的《安舒满三七》2009年的方法。麻醉下行正中切口。从迷走交感神经中仔细分离颈总动脉。用螺纹阻断双颈动脉(BCCAO) 30min后引起缺血，拔除螺纹后再灌注48h。颈部切口区域用线缝合。DL组动物在闭塞前10 min给予所有抑制剂(别嘌呤醇-10mg/kg、L-NAME-10mg/kg和尼美舒利- 20mg/kg)，预治疗7 d (500mg/kg)。

在再灌注期后，动物被处死，大脑被斩首，进行生化评估。SOD活性采用Kakkar等开发的方法测定，[21］．,CAT activity was measured by the method of Aebi et al, [22］．,MDA activity was measured by the method of Okhawa et al, [23]，采用Mullane等方法测定MPO活性，[24］．进一步对脑组织进行组织病理学研究，并对结果进行比较。

观察与结果

I/R组大鼠脑组织MDA、MPO水平明显升高，SOD、过氧化氢酶水平明显降低(图1 - 4)．组织病理学检查还显示有神经元变性、神经胶质细胞增生、充血、出血、淋巴细胞浸润及空泡化，提示脑损伤(公布)．

假手术组:脑组织SOD、CAT、MPO、MDA无神经功能缺损(图1 - 4)．组织病理学研究亦显示，组织内并无神经元变性(图6)．

灌胃组:脑组织SOD、CAT、MDA、MPO水平更接近I/R组(图1 - 4)．组织病理学检查亦显示神经元变性、充血及轻度空泡(图7)．

别嘌呤醇组:脑组织SOD、CAT水平较I/R组明显升高，MDA、MPO水平较I/R组明显降低(图1 - 4)．组织病理学研究也支持生化估计，显示对大脑的损害最小，可见轻度空泡(图11)．

别嘌呤醇+DL组:脑SOD和CAT水平明显升高，而MDA和MPO水平明显降低，与I/R组相似(图1 - 4)．组织病理学报告还显示，脑部几乎没有损伤，并伴有轻度充血(图12)．

DL组与I/R组比较，脑组织SOD、CAT水平明显升高，MDA、MPO水平明显降低(图1 - 4)．组织病理学检查显示神经元退行性变最小，轻度空泡，充血相对较低(以数字)．

L-NAME组:脑组织SOD和CAT水平下降，MDA和MPO水平明显升高，显示脑损伤(图1 - 4)．组织病理学结果显示，有大量神经元损伤，淋巴细胞浸润及空泡化(图9)．

L-NAME+DL组:与I/R组比较，脑组织SOD、CAT水平下降，MDA、MPO水平明显升高(图1 - 4)．组织病理学检查亦显示神经元变性、充血及空泡化(图10)．

尼美舒利组:与I/R组比较，脑组织SOD、CAT水平明显升高，MDA、MPO水平明显降低(图1-4)。组织病理学研究还显示，该组无神经元变性，细胞成分似乎正常(图13)。

尼美舒利+DL组:与I/R组比较，脑SOD、CAT水平明显升高，MDA、MPO水平明显降低，与尼美舒利组相似(图1 - 4)．组织病理学研究也显示，神经元损伤不大，仅出现轻度空泡(图14)．Oxidative stress is believed to be a major source for generation of post cerebral ischemic injury. Various experimental models of cerebral ischemic reperfusion injury showed significant neuroprotection when treated with antioxidants [25］．活性氧被认为是缺血器官再灌注后组织损伤最早和最重要的组成部分之一，脑损伤的程度似乎取决于缺血/再灌注的实验模式:缺血时自由基的产生是连续的，而再灌注时自由基的产生主要局限于缺血区域提供新鲜氧气的早期阶段。由于大脑氧化代谢活性高，多不饱和脂肪酸含量高，抗氧化能力相对较低，神经元细胞修复活性不足，因此很容易受到氧化应激的损伤。氧化损伤包括过量产生活性氧，包括脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤，可导致细胞死亡。此外，活性氧可以激活不同的下游信号通路，如黄嘌呤氧化酶(XO)通路，环氧合酶-2 (COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的过表达最近被认为是缺血性炎症的重要决定因素，这有助于脑损伤的进展[26］．脂质过氧化是脑损伤的主要机制之一。该机制涉及一个过程，不饱和脂类被氧化形成额外的自由基物种以及有毒的副产物，可对宿主系统有害[27］．在氧化环境中，多饱和脂类尤其容易受到这种类型的损伤，它们可以反应形成脂质过氧化物[28］．脂质过氧化物本身不稳定，经过额外分解形成一系列复杂化合物，包括活性羰基化合物[29］．在本研究中，我们观察到缺血再灌注组与假手术组相比，组织MDA活性增加，结果与以往的研究一致。单独使用大叶黄芪(500mg/kg p.o)可提供脑保护，但当DL与尼美舒利(20mg/kg i.p)联合使用时，观察到更显著的脑保护，这表明DL与尼美舒利具有协同作用。DL+ L-NAME (10mg/kg i.p)联合治疗无脑保护作用，DL+别嘌呤醇(10mg/kg i.p)也有一定的脑保护作用，这表明DL的某些黄嘌呤氧化酶性质参与其中。活性物质可以通过一些酶的和非酶的抗氧化机制减少或消除。SOD能催化超氧阴离子(O-2)变性为过氧化氢和分子氧，是最重要的抗氧化酶之一[30.］．在本研究中，与假手术组相比，缺血再灌注组SOD和CAT活性降低，结果与既往研究一致。［30.这可能是由于超氧阴离子的过量形成。SOD活性的降低会导致超氧阴离子的去除减少，这可能对大脑有害。酶水平的下降可能是由于过量的超氧阴离子可能使SOD失活，从而导致H₂O₂清除酶。单用DL可使SOD和CAT活性降低，而用尼美舒利(20mg/kg)可使SOD和CAT活性显著升高。与L-NAME同时使用时效果较差，但与别嘌呤醇(10mg/kg)一起使用时效果稍好。

炎症是脑缺血发病机制的重要组成部分。促炎分子如NO合酶-2 (NOS 2)、环氧合酶-2 (COX 2)、趋化因子和粘附分子与脑缺血损伤的发展有关。髓过氧化物酶(MPO)是一种由炎症部位活化的吞噬细胞分泌的高阳离子糖化血红素酶。MPO是一种参与自由基产生的酶。事实上，MPO使用H₂O₂和NO2¯生成活性氮[31］．

缺血再灌注组MPO酶活性较假手术组明显升高。单独给药DL显示出对炎症介质的抑制作用，但当DL与尼美舒利(20mg/kg i.p)同时给药时，它们被显著抑制。与I/R组相比，L-NAME组无脑活动，而别嘌呤醇组和DL+别嘌呤醇组表现出一定的脑保护活性。

结论

本实验通过对大鼠全脑缺血模型的研究，探讨了黄檀皮甲醇提取物的脑保护作用机制。进行超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、髓过氧化物酶、丙二醛生化检测和组织学检查。结果表明，黄檀提取物具有较强的脑保护作用，其作用机制可能是COX通路抑制剂，黄檀提取物与COX抑制剂具有协同作用，这可能与黄酮类化合物的作用有关。

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