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国际创新研究期刊》的研究在科学、工程和技术

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发展快速,可靠的再生系统使用Cotyledonary-Node方法在印度大豆基因型(大豆l .)

Alkesh哈达1Amit Kumar Gupta1,Theboral Jeevaraj2,Markandan Manickavasagam2,安迪Ganapathi2,莫妮卡快活1,医生Sachdev1
  1. 生物化学的博士学者,部门,印度农业研究所,新德里,India1, SRF1,生物化学,印度农业研究所,新德里,印度
  2. 博士学者,生物技术和基因工程,生物技术学院Bharathidasan大学Tiruchirappalli,泰米尔纳德邦,印度
  3. 协助教授,生物技术和基因工程,生物技术学院Bharathidasan大学Tiruchirappalli,泰米尔纳德邦,印度
  4. 教授,生物技术和基因工程,生物技术学院Bharathidasan大学Tiruchirappalli,泰米尔纳德邦,印度
  5. 技术军官,生物化学,印度农业研究所,新德里,印度
  6. 的生物化学教授,印度农业研究所,新德里,印度
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文摘

再生通过成熟子叶的节点组快速直接从外植体再生的植物更省时的,作为一个有效的策略我们开发了再生的协议通过单一拍摄使用子叶的节点快速和高效的印度3个大豆品种的协议。从单子叶的节点收集两个外植体和培养介质包含N6-benzylaminopurine (BAP)萌发,BAP和indole-3-butyric酸(IBA)拍摄感应,赤霉素(GA3)拍摄伸长和IBA外植体的支持。激素对所有基因型的最佳组合得到种子的萌发与1.0 mgl-1 BAP B5培养基补充一半,拍摄感应充分B5培养基有软面包卷1.0 mgl-1和IBA 0.2 mgl-1拍摄伸长GA3 0.75 mgl-1 MS培养基。在这些条件下,植株可能降价日内提出。观察,选择合适的媒介再生的大豆可以克服基因型相关的问题。这个再生系统可用于大豆转换

关键字
大豆基因型、转换、再生,子叶的节点。

缩写
BAP - 6-benzyl-aminopurine IBA -吲哚丁酸,GA3,赤霉酸- Murashige和斯女士。

介绍
大豆(大豆(l)美林)被广泛用作人类油和蛋白质来源,作为牲畜饲料。也一个源塑料、胶粘剂以及各种行业的加工食品。它含有40%的蛋白质和20%的石油,这是最高的蛋白质之间的脉冲。美国大豆产量是在第一个位置的年产量约8070万吨之后,巴西、阿根廷和中国。大豆在印度的年产量是1012万吨(FAOSTAT 2009)。
大豆产量的主要限制是对病原体和害虫,环境压力,可怜的授粉、收获指数低。传统育种者已经努力开发新的品种的大豆疾病、虫害和抗除草剂;和增加营养价值。但是,传统的育种项目有限制,因为大豆种质极其狭窄,大部分大豆品种很少使用的来自父母的行(Christou et al . 1990年)。Serkan et al。(2005)和Haliloglu(2006)报道,在高效的植物再生的基础协议,生物技术可以成功地应用于作物改良。
豆类是最顽固的体外操作但怀着极大的兴趣常规协议获得了稳定的转化株的主要谷物豆类如菜豆(菜豆),大豆(大豆),豌豆(Pisum一,花生(花生hypogea)和苜蓿(紫花苜蓿)、豆类以及模型,桶医生(Medicago truncata) (Christou 1992;Puonti-Kaerlas et al . 1990;拉塞尔et al . 1993年)。到目前为止有许多类型的主要外植体大豆通过直接器官发生再生。这些主要外植体包括子叶的节点(Cheng et al . 1980;Barwale et al . 1986;Hinchee et al . 1988;赖特et al . 1986;Shetty et al . 1992;金田et al . 1997; Shan et al. 2005), stem-node (Saka et al. 1980; Kim et al. 1990), primary leaf tissue (Wright et al. 1987a), epicotyl sections (Wright et al. 1987b), cotyledons (Mante et al. 1989; Franklin et al. 2004), plumules (Yang et al. 1990), hypocotyls (Kaneda et al. 1997; Dan and Reichert 1998; Yoshida 2002) and embryonic axes (McCabe et al. 1988; Liu et al. 2004). Regeneration through mature cotyledonary node has set rapid regeneration of plants directly from explants which is more time-saving and presented as an effective strategy. In general, soybean tissue culture is not only time consuming but also genotype dependent (Franklin et al., 2004). Each method has limitation for the production of transgenic plants and the regeneration protocol does not seem high enough for soybean transformation. Therefore, an improvement in the regeneration would contribute to an increase in the production of transgenic soybean. An efficient protocol on regeneration of different Indian soybean cultivars is reported in this study.

材料和方法
植物材料:
三个印度大豆的简历。335年JS, JS 95 - 60和NRC 37被用来规范再生协议与各种参数。基因型是来自大豆研究理事会(DOSR)、印多尔、中央邦、印度。
基媒体和文化条件
本研究中使用的介质是女士(Murashige和斯et al ., 1962)和B5 (Gamborg et al ., 1968)补充各种植物生长调节剂的浓度和组合。媒体与3%蔗糖和补充与0.6%琼脂凝固,调整pH值5.8 n氢氧化钠/ 1 n HCL然后热压处理过的121 - 123°C使用前20分钟。组织培养的房间被保持在26±2°C下十六的光强度的光暗周期60μmol m-2s-1。
外植体的制备和再生
干燥,成熟这三个品种的种子消毒用氯气处理种子由盐酸混合3.5毫升的12 N和100毫升漂白剂(4%次氯酸钠)为5 - 6小时(Di et al ., 1996)。五十消毒种子发芽被安置在介质(GM)(1/2力量B5补充3%蔗糖、0.6%琼脂和pH值5.8)补充各种浓度N6-benzylaminopurine (BAP) (0 mgl-1 1 mgl-1 2 mgl-1 3 mgl-1 4 mgl-1 5 mgl-1)。种植的种子被保存在一个组织培养室26岁±2°C下凉爽的白色荧光灯(90 - 150年μmol光子m - 2 s - 1)在18/6 h(光/暗)光周期为5 - 6天,或者直到子叶成为绿色和种皮裂开,但在第一个叶子扩展到子叶的长度(Olhoft et al . 2003年)。
根和下胚轴约的主要部分。3 - 5毫米低于下胚轴的子叶的节点被移除,分离子叶。垂直穿过剩下的下胚轴是用手术刀片。上胚轴随后被删除和100这样的外植体放置在拍摄感应介质(SIM)(满员B5培养基补充3%蔗糖、0.6%琼脂和pH值5.8)有恒定的BAP浓度(1 mgl-1)和不同浓度的indole-3-butyric酸(IBA) (0.5 0 mgl-1 0.2 mgl-1 mgl-1和1 mgl-1)。外植体保持10 - 12天在上述文化条件下,12天后,子叶的节点从外植体和削减1/3与新开发的芽外植体都被转移到拍摄伸长培养基(SEM)(完整的女士中补充3%蔗糖、0.6%琼脂和pH值5.8)与不同浓度的赤霉素(GA3) (mgl-1 mgl-1 0 mgl-1, 0.25, 0.50, 0.75 mgl-1和1.0 mgl-1)。外植体是子培养新的扫描电镜中直到芽细长的4 - 5厘米长。拍摄长度达到4 - 5厘米时,新开发的芽被安置在生根培养基(1/2 B5培养基补充与3%蔗糖,IBA 2 mgl-1, 0.6%琼脂和pH值5.8)。外植体保持在同一介质整个加油加油。15 - 20天,扎根植株的根形成硬化到potmix组织培养条件。10 - 12天之后转移到国家人工气候室设施,IARI,新德里成熟下16/8 h(光/暗)光周期和自然光线补充了1000 w高压钠灯。
实验设计和统计分析
四个因素包括软面包卷、IBA, GA3和大豆基因型进行了研究,参照上述描述再生协议。实验重复了三次检查每个因素对再生效率的影响协议。数据分析使用单向方差分析(方差分析)。治疗的平均值进行了分析使用邓肯多个测试范围(DMRT)。

实验结果
激素对种子萌发和芽的再生的影响
三个品种的种子发芽在一半B5培养基为5 - 6天。中补充了软面包卷在不同浓度(1 mgl-1, 2 mgl-1 3 mgl-1 4 mgl-1, 5 mgl-1),萌发的频率为97.2,98.8,98.9,98.7,98.7和98.6%(数据没有显示)。控制介质(BAP)缺席的种子发芽有深绿色的子叶,薄和下胚轴长和横向的根源。1日发芽的幼苗mgl-1 BAP的平均长度8.1厘米,绿色子叶和没有任何横向的根源。幼苗长度与激素浓度的增加逐渐降低(图1和表1)。
表1。BAP浓度对大豆的拍摄长度的影响外植体萌发培养基
图像
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三个复制的均值计算每个治疗和复制是由五种植物
值相同的信没有显著的不同根据邓肯的多个范围测试(DMRT)在5%的水平
外植体转移在SIM诱导芽与常数BAP浓度(1 mgl-1)和各种IBA浓度(mgl-1 mgl-1 0 mgl-1, 0.2, 0.5, 1 mgl-1)。数据记录在SIM孵化后10天。他们产生多个芽不定。没有明显的外植体再生频率差异与不同的激素组合(96.6,97.2,97.6,97.5%)(数据没有显示)。最长拍摄获得的平均长度为1.86厘米的组合软面包卷(1 mgl-1)和IBA (0.2 mgl-1)。但是,芽的长度减少,布朗宁接触表面的子叶的节点和下胚轴与IBA浓度的增加逐渐增加(图2和表2)。雷竞技网页版
表二。IBA浓度对大豆的拍摄长度的影响外植体在感应中补充1.0 mgl-1开枪
图像
三个复制的均值计算每个治疗和复制是由五种植物
值相同的信没有显著的不同根据邓肯的多个范围测试(DMRT)在5%的水平
10天后在SIM,不同浓度的外植体被安置在SEM Gibbrellic酸(GA3) (mgl-1 mgl-1 0 mgl-1, 0.25, 0.50, 0.75 mgl-1 g / l和1.0 mgl-1)。芽的长度在扫描电镜测量后20天。芽细长的赤霉素浓度。芽的长度逐渐增加了0.75 mgl-1赤霉素浓度平均4.3厘米。但是,长度下降(3.20厘米)在1.0 mgl-1赤霉素(图3和表3)。
Table3。赤霉素浓度对大豆的拍摄长度的影响外植体在拍摄伸长的媒介
图像
三个复制的均值计算每个治疗和复制是由五种植物
值相同的信没有显著的不同根据邓肯的多个范围测试(DMRT)在5%的水平
方差分析表显示,结果是单射再生成熟子叶的节点上显著(P < 0.01)(表4)。芽外植体时最大的长度被保存在最佳浓度的激素。
表4。拍摄的一维方差分析再生从大豆(大豆子叶的节点(l)美林)
图像
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e实验误差
*水平的差异P < 0.01
比较不同的激素和基因型
结果显示明显的差异响应拍摄再生荷尔蒙的各种组合。单拍再生在SIM激素的结合。然而,第二个治疗。,SEM supplemented with various concentration of GA3, single shoot elongated. The results summarized in Tables (1, 2, 3) illustrate the best combination of the hormones to regenerate single shoot. In Table 1, results showed the best combination for germination on MS medium supplemented with 1 mgl-1 of BAP for all genotypes. In Table 2, it is evident that the best combination for induction of single shoot is the medium supplemented with 1 mgl-1 BAP and 0.2 mgl-1 IBA for all genotypes. From the data in Table 3, it is clear that the medium supplemented with 0.75 mgl-1 of GA3 was found to be best for elongation of shoots for all genotypes.
图像
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基因型之间的比较
效率的基因型(JS 335, JS 95 - 60和NRC 37)是研究确定影响再生。这些基因型对再生效率没有影响。
再生利用子叶的时间节点
灭菌后,种子被通用汽车5 - 6天。两个外植体切除从每个幼苗和SIM卡。10 - 12天后,单拍花蕾出现可以直接从床再生节点没有愈伤组织阶段。以后,诱导单射在SEM被转移到长3 - 4厘米在20 - 24天。大部分的细长的芽生根培养基在10 - 15天。整个体外再生周期40 - 50天内完成。根植物在锅里混合硬化,然后转移到国家人工气候室设施成熟。

讨论
研究人员已经证明,子叶的节点是拍摄好候选人外植体再生(Hinchee et al . 1988;Oholf et al . 2007年)。本研究有优于其他方法。首先,该系统花费更少的时间比其他外植体使用。整个再生过程缩短到40 -天。其次,使用子叶的节点作为外植体可能导致更少的老茧中BAP浓度高的补充。印度3个大豆品种在目前的研究中使用标准化再生协议,这表明,该协议是基因型无关的。
与细胞分裂素刺激萌发培养基补充射击。发芽的幼苗中没有细胞分裂素显示异常的迹象,因此没有选择研究。BAP被观察到1.0的最佳浓度mgl-1生产健康拍摄所有的种子。但是,拍摄长度开始减少时,细胞分裂素浓度进一步增加。这种现象类似于微体繁殖研究不同的香蕉品种,在拍摄BAP水平较高的长度增加到22.2μM之后拍摄长度也开始下降(Shirani et al . 2010年)。唐et al。(2012)也报道,增加BAP浓度减少拍摄核扩散和增加不正常芽的分化和抑制芽的伸长。
通用的标准化后,子叶的节点被保存在拍摄诱导培养基诱导芽。提供的介质是细胞分裂素(BAP)细胞分裂和生长素(IBA)拍摄归纳。拍摄感应介质与不断补充BAP浓度(1 mgl-1标准化通用)各种IBA浓度。拍摄的理想浓度诱导发现0.2 mgl-1所有三个基因型。拍摄长度减少,变得异常的上方和下方0.2 mgl-1 IBA浓度(表2)。这一发现是由观察Shirani et al。(2010);唐et al。(2012)。
10 - 12天后,诱导芽被置于扫描电镜拉长芽。媒介与不同浓度的赤霉素补充。在这项研究中,唯一的赤霉素是用于拍摄伸长由于各种原因。首先,它是最强大的生长促进剂,因为它们增加节间间距,第二GA3控制杆伸长通过刺激细胞分裂和伸长,拍摄第三GA3促进统一的生长通过细胞增大和第四,刺激植物生长高,伸长与亮绿色叶子。记住上面的点,GA3用于拍摄伸长。拍摄伸长下降低于和高于0.75 mgl-1赤霉素。这个结果表明,赤霉素浓度的增加降低了拍摄长度和增加了异常芽的形成。Olhoft et al。(2003)有不同的激素组合用于拍摄伸长,但再生的时间比较长。
这是首次研究了印度3个大豆品种的再生使用子叶的节点作为外植体。有些差异中观察到的基因型,拍摄长度,但它是可以接受的(表2)。观察,选择合适的介质再生的大豆可以克服基因型相关的问题。总的来说,再生周期已经缩短到只有40 -天,最短时间的大豆再生。这种标准化的再生系统将兼容农杆菌介导大豆转换,之后更新的害虫和疾病的控制策略。

结论
大豆油和蛋白质的需求正在增加,大豆质量的提高和生产通过遗传转化成为一个有关问题的世界。本研究的相关性来确定基底媒体的最佳浓度和激素在改善大豆再生和减少使用cotyledonary-nodes再生的持续时间。印度以及比较不同的大豆品种在本研究报告。因此开发一个高效、简单、一致的协议转换为本地可用的商业基因型大豆将极大地帮助转换。

确认
ICAR印度政府的财政支持下NFBSFARA程序。我们也感谢科学家们和工作人员在国家人工气候室设施,印度农业研究所,110012年新德里,印度为他们指导和支持受控条件下的植物生长。

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