开发和验证的干血血清/现货组合酶联免疫吸附试验的分析Anticitrullinated蛋白质抗体:一个新的类风湿性关节炎生物标志物的平台

文摘

本研究的目的是结合血清现货(DSS)和干干血现货(DBS)技术酶有关免疫吸附试验(ELISA)检测评估anticitrullinated肽和蛋白质的抗体(ACPA)在类风湿关节炎(RA)患者。两个新的分析DSS——ELISA-ACPA和DBS-ELISA-ACPA协议相比,开发和验证一个既定血清ELISA-ACPA协议。血清样本,从RA患者(n = 24)和健康成人(n = 5)进行了测试。分析性能在所有三个协议相当ACPA 20 - 1000 U /毫升浓度范围。Intra-assay和inter-assay精度(% CV)的原始光密度(OD)数据范围从0.8 - -4.5%和13.7 - -27.3% ELISA-ACPA平台(10个月周期),5.6 -15.3%和31.0 -61.7% DSS-ELISA-ACPA平台(10个月周期),和7.0 - -21.2%和24.3 -39.3% DBS-ELISA-ACPA平台(两个月的时间),分别。原始的OD数据安装使用对称的s形四parameter-logistic (4 pl)曲线的技术。国米,测定精度(% CV)和准确性(%恢复)的校准标准范围从0.2 - -12.5%和85 - 113% ELISA-ACPA平台,1 - 32%和77 - 106% DSS-ELISA-ACPA平台,和1 - 19%和95 - 105%的DBS ELISA-ACPA平台,分别。ELISA-ACPA之间的相关性和DSS-ELISA-ACPA平台24 RA和5健康控制血清样本高(r = 0.9873, p < 0.0001)。新的DSS / DBS-ELISA-ACPA平台可能是一个准确和经济评估RA的患病率和早期检测方法在大规模的人口研究。

关键字

血清,干干血,ELISA,风湿性关节炎,生物标志物,Anticitrullinated肽和蛋白质抗体,ACPA

介绍

滤纸的应用作为一个累积技术来收集和储存干生理体液(如血清、血浆、血液、尿液等)为矩阵点之后通过定量和定性分析的分析发现了这些矩阵点一百多年前(1,2]。这种滤纸技术仍然是高度利用广泛的今天临床应用程序(3- - - - - -10]。血清现货(DSS)干和干血现货(DBS) (11- - - - - -13]技术包括应用下降(10-40μL)血清/血液和允许它的传播和渗透多孔滤纸与随后的蒸发和干燥创建一个位置。从现场剪一个小圆盘,圆盘中的分析物可以用溶剂从滤纸中提取和检测使用一个适当的分析技术。溶剂萃取过程的选择在很大程度上依赖于分析物的物理性质(如小分子或大分子)和分析检测方法利用。筛选了的检测分析物从DSS或DBS主要采用分析技术包括聚合酶链反应(PCR)扩增DNA化验(14),气相色谱法(GC) /液相色谱(LC)技术结合,或在线与串联质谱分析(MS / MS)测定(15)和酶联免疫吸附测定(ELISA) [16]。这些方法统称为用连字符连接DSS-analytical或者DBS-analytical技术。在1990年至2017年之间,包含关键字的出版物的数量在SciFinder“干血点”^®数据库(美国化学学会、化学文摘服务:哥伦布,俄亥俄州,美国)是2016年发生在五千年,大约有四百的出版物。用连字符连接的成功应用DSS的原因——DBS-analytical技术包括他们是廉价和方便的侵害比静脉取样技术的过程。其他优点还包括一个简单的保护血液/血清/血浆样本进行短期和长期存储,一个更简单的方法将样本从一个地方转移到另一个比液体样品,用最小的生物危害风险micro-volume取样大小,广泛应用于现代分析方法,和缓解自动化DSS和DBS技术。DBS-analytical应用程序是非常成功的在新生儿筛查遗传性代谢病等领域(8,13,17,18),筛查药物滥用(19)、治疗药物监测、临床发展规划和一系列的生物分析(5,6,9,10,20.,21]。不幸的是,DSS——或DBSanalytical技术也有一些技术挑战包括血比容水平(即。,the ratio of the volume of red cells to the volume of whole blood) affecting blood viscosity which in turn influences the formation of blood spots [22)不同的滤纸给予不同的量化结果(23),分析物稳定性问题,分析物的不完整的溶剂洗脱控制准确的定量滤纸,灵敏度、线性、准确性、精密生理相关的分析物的浓度,分析方法的不相容。所有这些缺点,最重要的方面影响有效的创建位置时结果不完全干燥滤纸,和样本点内的不均匀会导致偏见和不精确的定量结果。因此,用连字符连接的新实现DSS——或者DBS-analytical技术需要充分验证提供有意义的生理效果。

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病影响~世界上1%的人口(24]。这种疾病出现时免疫系统攻击膜内壁周围和润滑关节(即。(滑膜)25]。虽然RA的确切发病机制仍不清楚,这种疾病的特点是广泛的滑膜炎导致慢性关节炎症和粘多糖润滑液体损失导致软骨和骨破坏。RA临床表现,如疼痛、肿胀和僵硬的脚,膝盖,手、手腕、手肘通常因病人的严重程度不同。建立了RA患者,该病导致促炎症细胞因子和免疫细胞组成26),创建独特的血清自身抗体(27),和细胞代谢活动的变化28]。蛋白质组学和代谢组学研究表明,戏剧性的变化在细胞酶活性和新陈代谢比较RA患者和健康志愿者(29日,30.]。患有风湿性关节炎通常规定非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),糖皮质激素,或diseasemodifying治疗风湿病的药物(DMARDs),如甲氨蝶呤(MTX) [31日,32)并发症的增加了一层蛋白质组学和代谢组学解释。因此,典型的RA患者有独特的自身抗体,内源性代谢物,生物和外源性物质在血液、血清、血浆,滑膜液可作为疾病生物标记物(33]。

目前的数据表明,治疗RA早期课程可能提高对治疗的反应,因此,减缓疾病的进展,防止残疾。临床症状,识别RA-related自身抗体,内源性生物标志物代谢产物(34)可能有助于疾病的早期诊断。常见的血清学比浊法和浊度测定法检测包括自身抗体的检测对类风湿因子(RF)的免疫球蛋白(Ig)包括免疫球蛋白,IgA、IgM同形像,检测c反应蛋白质(CRP)。血清学RA ELISA分析包括14-3-3η蛋白质的自身抗体,抗体carbamylated homo-citrulline含有蛋白质-蛋白质中赖氨酸转译后的修改,和anti-perinuclear因素和anti-Sa抗体水平集体称为anticitrullinated多肽和蛋白质抗体(ACPA)。射频和CRP是炎症,因此,普通蛋白的生物标志物可能在健康个体和其他自身免疫性疾病比RA患者(如硬皮病、红斑狼疮、神经病变等)(35- - - - - -39]。到目前为止,citrullinated蛋白质已经被广泛的研究。而髓磷脂碱性蛋白,栏目,类型I和II型胶原蛋白,和几组蛋白蛋白质通常含有瓜氨酸肽残留物,纤维蛋白等蛋白质,纤维蛋白原,波形蛋白等在RA患者citrullinated蛋白质转译后的修改(图1)。正是这些citrullinated蛋白质(即转译后的修改。中创建的,抗原)组织炎症刺激ACPA的生产。ACPA特定血清学诊断的生物标志物RA以来,许多citrullinated自身抗原已确定,可以用在小说间接免疫测定包括循环citrullinated肽(CCP)抗体合成中间丝相关蛋白来源于人类的序列(CCP, CCP2 CCP3),抗体变异citrullinated波形蛋白(MCV),和自身抗体citrullinated在丝蛋白精氨酸残基。研究表明,ACPA免疫测定RA发展的敏感和预后,因为ACPA存在RA的发病症状之前(34- - - - - -43]。ACPA免疫测定RA高特异性歧视RA患者与其他疾病产生自身免疫炎症反应。通常,ACPA敏感性(ELISA-APCA分析正确识别个人的能力与RA)从60 - 80%,特异性(ELISA-APCA分析正确识别个人的能力没有RA)从85 - 99%。

在本文中,我们开发了分析协议的使用用连字符连接DSS-ELISA和DBS-ELISA平台与人类血清和血液RA生物标志物ACPA量化。我们开发了这些新平台支持RA社区调查努力估计风湿性关节炎的患病率和早期检测在大规模的人口研究。由于ACPA在RA患者的效价是美国大学的重要组成部分风湿病学(ACR) /欧洲联盟对风湿病(欧拉描述)RA分类标准44,45),它将会更加节省成本,如果结果更可靠流行病学问卷调查收集与DBS样本同时建立ACPA自身抗体水平(46]。DSS / DBS-ELISA-ACPA协议已经开发,以确保准确性、精度、线性度、可靠性和建立检测极限。用连字符连接新技术的性能进行比较匹配的成年患者血清样本的历史RA (n = 24)和健康(n = 5)控制样本。虽然DBS-ELISA平台通常用于临床应用几种不同类型的自身抗体(9,10- - - - - -12,15),RA DSS-ELISA-ACPA和DBS-ELISAACPA平台的发展并没有在文献中报道的最好的知识。

化学物质、样品、材料和方法

化学物质

以下试剂是购买作为ACPA酶联免疫试剂盒(目录号:KA1268)从Abnova(台北,台湾):APCA捕获抗体(即。抗原)绑定到96孔板microwells;APCA校准器(0,40100,300,和1000 U /毫升)含有磷酸缓冲盐(PBS),牛血清白蛋白(BSA)、洗涤剂和叠氮化钠(NaN₃,0.09%);样本缓冲区包含南₃(< 0.09%),PBS、BSA和洗涤剂;检测antibody-horseradish过氧化物酶(合)含有防腐剂ProClin共轭300 (0.05%)、2-methyl-4-isothiazolin-3-one(< 0.0015%),和5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin -一(< 0.0015%);检测底物的解决方案包含3、3´,5、5´-tetramethylbenzidine(三甲,0.04%)、二甲亚砜(DMSO, < 1.0%)、和1、2,6-hexanetriol (< 5.0%);盐酸溶液停止(HCL, > 1 - 5%)在pH值< 1 20°C;清洗解决方案包含三(羟甲基)氨基甲烷,洗涤剂和南₃(< 0.09%)。去离子水是来自内部Milli-Q净水系统(美国马萨诸塞州默克密理博,Billerica)。常见的溶剂和试剂获得EMD化学品(美国新泽西州Gibbstown)。

样品

人类的整体血二钠ethylenediaminetetraacetate (EDTA)样品和匹配的人类血清样本来自生物专业公司(科尔,宾夕法尼亚州,美国)。血液样本集中(PB01)是由混合等于体积(2.5毫升)的个人四个健康男性受试者的血样没有RA年龄在第45年。人类RA血清样本(通过RA024 RA001)获得从詹森研发、LLC(春天的房子,宾夕法尼亚州,美国)表1)。RA001-RA024血清样本收集病人的低剂量MTX(做毫克/周)。身体质量指数、身高和体重对每个样本有免疫测定RF和anti-CCP2数据。简而言之,RA血清样本从4男性受试者(RA003, RA017 RA022, RA023)年龄在52 - 69年和20个女性受试者的年龄在21 - 76年。免疫测定RF和anti-CCP2数据收集RA001 - RA024 Covance血清样本的中心实验室服务(http://www.covance.com/)。使用乳胶immunoturbidimetry射频数据收集方法的内部和inter-assay精度2.2% -5.8% -5.3%和3.1%变异系数(%的简历),分别。分析的范围是10 - 600 U /毫升的价值< 15 U /毫升正在考虑对射频不利。数据收集anti-CCP2使用罗氏Cobas e601分析仪和罗氏anti-CCP工具包(罗氏诊断,印第安纳波利斯,印第安纳州)。内部和inter-assay精度为0.6% -1.9%,-1.0%和1.3%。分析的范围是9.0 -500 U /毫升的价值< 17 U /毫升anti-CCP2被认为是消极的。使用- RA截止值< 15 U /毫升的射频数据和< 17 U /毫升anti-CCP2数据,样本RA005和RA012都是消极的射频和anti-CCP2免疫测定。样品RA002、RA008 RA020产生积极或消极的结果取决于所使用的试验。剩下的19个RA样本积极在射频和anti-CCP2免疫测定。RA0025血清样本来自Bioreclamation溶(美国纽约韦斯特伯里,产品目录号:HMSRM-RA)是一个RA 67岁女性话题每日服用15毫克的MTX。 The RA0025 serum sample was determined to have an ACPA level of 2000 U/mL and was used in linearity studies. Healthy control human serum samples (HC026 through HC030) were obtained from Bioreclamation IVT (Westbury, New York, USA, catalog number: HMSRM). These serum samples were from healthy male subjects ranging in age from 38-54 years. A pooled serum sample (PS01) was prepared from these samples. The body mass index, height, weight, and anti-CCP2 data for RA025 and HC026-HC030 were not available from Bioreclamation IVT.

表1:人口结构和免疫测定的数据样本。

材料

干血卡和设备

DSS / DBS卡(FTA-DMPK-C、目录号:WB129243)从通用电气购买医疗保健生命科学(美国新泽西州皮斯卡塔韦镇)。低蛋白结合管(蛋白质LoBind管,产品目录号:022431081)和低蛋白结合96 -孔板(蛋白质LoBind板,产品目录号:951032107)购买来自埃普多夫(德国汉堡)。DSS / DBS-ELISA试验中使用的特定的设备描述;然而,任何类似的功能可以很容易地替换模型。打孔(哈里斯Uni-Core打孔,目录号:WB100038)和垫(哈里斯切割垫,产品目录号:WB100020)用于收集3.0毫米盘从DSS / DBS卡购买通用电气医疗集团生命科学。一个ELx800标仪和一个ELx405买来洗板机Bio-Tek仪器有限公司(美国佛蒙特州Winooski)。

方法

从血液样本制备血清样本

血液样本被允许凝块后,血清分离和离心收集的47]。血清样本明显non-hemolyzed和储存在≤-80°C。一个实验之前,血清样本解冻至室温(RT;20 - 25°C)。

ELISA-ACPA:制备血清血清样本和标准校准曲线使用Abnova ACPA工具包校准器

ELISA-ACPA试验,所有样本血清样本稀释1:10 0缓冲区。ACPA (U /毫升)的浓度血清样本测量从校准曲线使用Abnova ACPA工具包校准器没有修改(如20、40、100、300和1000 U /毫升)。在执行ELISA-ACPA之后,如果样本高于ACPA水平最高的校准标准(1000 U /毫升)的校准曲线,汇集的血清样本pre-diluted正常人类血清(PS01)前1:10 0样品缓冲液稀释步骤以确保ACPA值属于校准曲线。在pre-dilution没有使用的情况下,ACPA值报告为大于最高的校准标准或更低,最低的校准标准。血清所有校准所需的体积和质量控制血清样本100毫升。所有的血清样本和校准器ELISA-ACPA过程如下面。

DSS-ELISA-ACPA DBS-ELISA-ACPA: DSS校准标准的准备和星展

因为它是不可能的商业获得一个真实样品citrullinated抗体的一个已知的浓度,下列程序用于生成DSS / DBS校准标准。血清样本RA009(射频:805和反CCP2: 330 U /毫升;看到表1)被选为ACPA参考标准的来源。ACPA浓度水平RA009是1970±355 U /毫升使用ELISA-ACPA过程如下面。因此,RA血清样本RA009被用作ACPA所有实验掌握股票的解决方案。RA009血清股票的解决方案与池正常的人类血清稀释(PS01)生成DSS血清校准器(例如31,63,125,250,500,1000 U /毫升,20、40、100、300、1000 U /毫升)。血校准器是准备通过正常的人类血液(PB01)和扣球RA009血清股票的解决方案来生成DBS血液校准器(如20、50、100、250、500、1000 U /毫升)。所有血液/血清校准样品跟着DSS / DBS-ELISA-ACPA过程如下面。

DSS / DBS-ELISA-ACPA:试验过程

试剂都在RT开始之前的实验和20μL血液、血清、血清校准器,血液校准器和空白的解决方案是准确地应用于预印圆的中心可能与吸管不碰牌技巧。被小心地确保biofluid解决方案迅速和彻底饱和圆(正面和背面)的滤纸,避免不应用多个滴解决相同的位置。DSS / DBS卡片原状约5分钟。这个时段,卡片是风干后大约2小时在黑暗中RT。DSS / DBS卡片是立即处理或储存在短期存储(即4°C。,几周)或-20°C(即长期存储。,a few months) in a sealed plastic bag with desiccant added to reduce humidity. For reliable data, it is extremely important that this procedure is accurately followed.

过程DSS / DBS卡,3.0毫米盘穿孔从现场的中心,包含空白,血液/血清校准器,和个人的血液/血清样本。硬盘被放在96 - LoBind盘子,和200年μL样品缓冲(样品)添加到井中。样品缓冲来自ACPA酶联免疫试剂盒(目录号:KA1268)从Abnova(台北,台湾)包含NaN3 (< 0.09%), PBS、BSA和洗涤剂。96 - LoBind盘子轻轻摇动了2小时在RT Ig抗体提取。提取被删除从96 - LoBind盘子和转移到LoBind管。所有血液/血清样本和校准标准遵循ELISA-ACPA过程如下面。

ELISA-ACPA:试验过程

联盟的ELISA分析制药(http://www.alliancepharmaco.com/quality-performance/expertise/)。定量ELISA-ACPA试验中使用一种间接酶免疫分析法检测系统组成的抗原citrullinated蛋白质绑定到的塑料胶96 -微量滴定板,正面和负面的血清样本含有免疫球蛋白对citrullinated蛋白质,anti-antibody-HRP-conjugate HPR酶底物。所有ELISA组件存储在黑暗中使用前8°C。在实验开始之前,ELISA组件被允许温暖RT。

血清样本,DSS / DBS样本,校准标准和以前准备的清洗解决方案允许温暖rt,血清样本(100μL)和欣赏校准样品(100μL)直接添加到一个包含涂层抗原96 -威尔斯板。板是在RT 30分钟轻轻摇动,让免疫球蛋白抗体对citrullinated蛋白质样品中抗原结合。在这个时期之后,microwells的内容被丢弃,microwells洗了三次300μL清洗解决方案。anti-antibody-HRP-conjugate(100μL)添加到每个microwell板是在RT 15分钟轻轻摇动,让共轭的形成/抗体/抗原复杂。在这个时期之后,microwells的内容被丢弃,microwells洗了三次300μL洗涤液除去任何的共轭。合检测酶底物(即。,One hundred.μL, TMB solution) was added to each microwell and allowed with gentle shaking to incubate at RT for 15 minutes. After this time period, the addition of 100 μL of an acid solution was added to each well and allowed to incubate for 5 minutes with gentle shaking at RT. This acid solution process stops the enzyme reaction forming a yellow end-product. The optical density (OD) at 450 nm of this yellow color was measured. The intensity of the yellow color was directly proportional to the concentration of the ACPA present in the serum/blood sample.

ELISA-ACPA:校准曲线计算

ELISA-ACPA后和/或DSS / DBS-ELISA-ACPA程序完成后,450海里的OD黄色的96孔板测量。原始的OD数据是使用Bio-Tek标和加工使用Gen5软件(美国佛蒙特州Winooski)。额外的处理计算进行使用Microsoft Excel(美国华盛顿雷德蒙德)或GraphPad棱镜6(美国加州拉霍亚)。空白的均值OD复制测量和减去原始OD数据测量。任何稀释因素应用于指定的数据。浓度的标准曲线是由绘图标准在对数尺度(轴)与相应的OD吸光度(轴)和拟合对称s形四parameter-logistic (4 pl)曲线使用没有权重。

(1)

下面的符号是用于s形4 pl方程:y表示OD,字母A表示渐近线价值低;B表示曲线的斜率;C表示曲线的中点集中值;D表示上层渐近线价值;x表示ACPA U /毫升的浓度单位。ACPA的浓度,根据标准曲线和样品测定下列方程恢复健康。

(2)

重要的是要记住,s形4 pl方程只能用于计算样品的测量结果在低渐近线值和上渐近线值d方程不应该用来插入ACPA浓度超过此范围。ACPA浓度计算的准确性也极端的s形4 pl方程将减少小型OD值的变化导致大型计算浓度的变化。

ACPA在DBS的浓度可以估计设备校准曲线和DBS校准曲线。如果设备校准曲线用于测量ACPA浓度DBS,一张空白盘被添加到每个设备标准(一个3.0毫米盘每200 uL标准的解决方案)。装备标准也认为DBS样品提取过程一样。

统计分析

单变量数据分析使用Microsoft Excel(美国华盛顿雷德蒙德)或GraphPad棱镜6(美国加州拉霍亚)软件的统计比较的数据。平均值,标准偏差(SD)、皮尔森的R相关,%简历(SD /意思),和%复苏(观察/预期)计算。据报告值均值±SD。统计显著性分析使用一个未配对的学生表示统计显著性t检验,p < 0.05。

结果

ELISA-ACPA装备标准内部/ Interday精密度和准确度的研究

为了比较和验证,ELISA-ACPA的精密度和准确度,DSS-ELISA-ACPA, DBS-ELISA-ACPS化验测定。盘中(within-run)和interday (between-run)测定精密度和准确度的Abnova ELISA-ACPA工具通过分析ACPA浓度标准由制造商提供,24 RA血清样本(通过RA024 RA001)和5(通过HC030 HC026)健康的血清样本。使用线性日志坐标绘制原始OD数据对ACPA浓度(U /毫升)标准中提供ELISA-ACPA工具包所示图2。盘中精度之间被定义为%的简历复制样品评估3复制样品和范围从0.8 - -4.5%,平均2.5±1.6%的精度。interday精度评估与6复制样品在10个月期间和范围从约13.7 - -27.3%,平均精度约为20.6±4.9%。

原始的光密度数据拟合使用的s形曲线4 pl方程1,显示了生成的结果表2。平方,均值和标准差计算使用标准的统计方法。较低的渐近线值之间存在着显著的差异,而其他参数是合理的可再生的内部和inter-assays。使用个人4 pl参数,原始的OD数据转换为ACPA浓度(U /毫升)单位使用方程2和平均(表3)。ACPA浓度范围的20 - 1000 U / mL,盘中ELISA-ACPA试验显示,平均精度(% CV)平均约3.1±4.5%,盘中99±11%的精度(%恢复)。这里精度定义为观察到的回收率平均值除以期望值。ELISA-ACPA试验显示平均interday精度约为5.0±5.3%,平均interday 99±10%的准确性。这些结果符合工厂的报道盘中(5.7%)和interday精度(7.4%)。

表2:平均校准曲线拟合参数ELISA-ACPA装备标准:盘中(n = 3)和interday (n = 6)。

表3:ELISA-ACPA装备标准:盘中,interday校准。

在表4,盘中线性研究RA血清样本(RA009;1970±355 U /毫升)。线性动态范围是评估使用3复制样品在31 - 985 U /毫升的浓度范围。RA009血清样本连续稀释混合血清样本(PS01)检查盘中上,中位数和化验浓度范围的低端。上部浓度范围(985 - 493 U /毫升)的精度范围从3 - 14%,而精度范围在106 - 146%之间。中位数浓度范围(246 - 123 U /毫升)的精度范围从5 - 7%,而精度范围在86 - 109%之间。低浓度(62 - 31 U /毫升)的精度范围从7 - 8%,精度范围在81 - 89%之间。这些结果与线性报道一致研究对于这个ELISA-ACPA化验。制造商的建议- RA截断值对于这个ELISA-ACPA化验是< 20 U /毫升。

表4:盘中ELISA-ACPA装备标准:线性结果RA009样本*。

人类血清样本ELISA-ACPA水平RA

24 RA血清样本的盘中精度(通过RA024 RA001)和5健康血清样本(通过HC030 HC026)测量使用ELISA-ACPA试验(图3)。ACPA浓度水平,在20 - 200 U /毫升精度平均为28%,在200 - 500 U /毫升精度平均为17%,而在500 - 1000 U /毫升的范围精度平均为13%。血清样本RA005、RA006 RA008、RA012 RA015, RA019 ACPA浓度水平< 20 U / mL,因此,这些样本被认为为RA根据ELISA-ACPA试验阴性。有趣的是,RA005 RA012都使用射频(即对RA不利。,截止< 15 U / mL - RA)和反CCP2((即。,截止< 17 U / mL - RA)免疫测定(表1),因此,符合当前的结果。RA008,其余4样品RA006 RA015, RA019混合产生正面/负面结果之间的三个化验。5健康控制血清样本(通过HC030 HC026)水平ACPA浓度< 20 U /毫升(数据中没有显示图3)。

总之,这三个免疫测定(RF anti-CCP2,表1ACPA,图3)是一致的在预测积极或否定所有RA血清样本RA截止值(RA001-RA024)除了RA002 RA006, RA008, RA009, RA019和RA020混合正面/负面结果之间的三个分析。比较anti-CCP2和ELISA-ACPA免疫测定的数据,我们发现这两个技术是一致的在预测积极或否定所有RA血清样本RA截止值(RA001-RA024)除了RA006和RA015。

DSS-ELISA-ACPA标准内部/ interday精密度和准确度的研究

盘中和interday精密度和准确度测定DSS-ELISA-ACPA平台24 RA血清样本(通过RA024 RA001)和5健康血清样本(通过HC030 HC026)。使用线性日志坐标绘制原始OD数据使用标准血清RA009 ACPA原液准备校准标准所示图4。盘中精度评估与3复制样品和范围从5.6 - -15.3%,平均11.2±4.0%的精度。interday精度评估4复制样品在10个月期间和范围从约31.0 - -61.7%,平均精度约为51.8±12.1%。原始的OD数据拟合使用的s形曲线4 pl方程1。使用个人4 pl参数(表5),原始的OD数据转换为ACPA浓度(U /毫升)单位使用方程2的平均结果表6。在ACPA浓度范围为20 - 1000 U / mL, DSS-ELISA-ACPA试验显示平均盘中精度约为20.6±20.6%,盘中平均92.2±21.0%的准确性。ACPA浓度范围的31 - 1000 U /毫升,DSS-ELISA-ACPA试验显示平均interday精度约为13.5±12.1%,平均interday精度为95.0±12.1%。

表5:平均校准曲线拟合参数DSS-ELISA-ACPA标准:盘中(n = 3)和interday结果(n = 4)。

表6:DSS-ELISA-ACPA标准:盘中(n = 3)和Interday结果(n = 4)。

在表7,线性研究RA血清样本RA0025使用DSS-ELISA-ACPA平台。这个RA血清样本连续稀释混合血清样本(PS01)和应用DBS卡片检查上,中间值和化验浓度范围的低端。线性动态范围是评估使用3复制样品的浓度范围500 - 62.5 U /毫升。上500 U /毫升浓度的精度3%,准确性为103%。中位数浓度范围(250 - 125 U /毫升)的精度范围从1 - 4%,而精度范围在115 - 126%之间。低浓度62.5 U /毫升的精度21%,准确性为93%。

表7:DSS-ELISA-ACPA盘中线性结果RA0025样本*

人类血清样本DSS-ELISA-ACPA水平RA

24 RA血清样本的盘中精度(通过RA024 RA001)和5健康血清样本(通过HC030 HC026)测量使用DSS-ELISA-ACPA试验(图5)。ACPA浓度水平在20 - 200 U /毫升精度平均为27%,在200 - 500 U /毫升精度平均为25%,而在500 - 1000 U /毫升的范围精度平均为26%。所有24 RA血清样本(通过RA024 RA001) ACPA浓度> 20 U /毫升,因此,RA的所有样本被认为是积极的。5健康血清样本(通过HC030 HC026) < 20 U /毫升ACPA浓度水平,被认为是不利于RA(数据没有显示)。

比较ELISA-ACPA和DSS-ELISA-ACPAACPA免疫测定的数据,我们发现两种技术是一致的在预测积极截止值18 RA血清样本。血清样本RA005、RA006 RA008、RA012 RA015和RA019混合两种技术之间的正面/负面结果。

DBS-ELISA-ACPA标准内部/ interday精密度和准确度的研究

DBS校准标准准备使用人类的RA血清样本RA009 (1970±355 U /毫升)作为ACPA股票的解决方案。血校准器是准备通过池正常人类血液(PB01)和它与RA血清股票飙升的解决方案来生成DBS血液校准器(例如20、50、100、250、500、1000 U /毫升)。盘中和interday每个校准标准测定精密度和准确度DBS-ELISA-ACPA平台线性日志坐标被用来绘制原始光密度数据所示的校准标准图6。盘中精度评估与3复制样品和范围从7.0 - -21.2%,平均13.1±4.6%的精度。interday精度评估与3复制样品在两个月的时间内,从-39.3%至24.0不等,平均精度约为29.9±6.0%。原始的OD数据拟合使用的s形曲线4 pl方程1 (表8)。使用个人4 pl参数,原始的OD数据转换为ACPA浓度(U /毫升)单位使用方程2和平均(表9)。在ACPA浓度范围为20 - 1000 U / mL, DBS-ELISA-ACPA试验显示平均盘中精度约为4.8±2.2%,盘中平均102.3±5.9%的准确性。DBS-ELISA-ACPA试验显示平均interday精度约为5.2±7.3%,平均interday精度为99.7±3.7%。

表8:平均校准曲线拟合参数DBS-ELISA-ACPA标准:盘中(n = 3)和Interday结果(n = 3)。

表9:DBS-ELISA-ACPA标准:盘中(n = 3)和Interday结果(n = 3)。

在表10盘中,线性研究RA血清样本RA009使用DBS-ELISA-ACPA平台。这个RA血清样本飙升到混合的血液样本(PB01),然后连续稀释使用相同的混合的血液样本。这些样本被应用于星展银行卡片检查上,中位数和化验浓度范围的低端。线性动态范围是评估使用3复制样品的浓度范围62.5 -500 U /毫升。上500 U /毫升浓度的精度7%,准确性为103%。中位数浓度范围(250 - 100 U /毫升)的精度范围从5 - 12%,而精度范围在96 - 105%之间。低浓度62.5 U /毫升的精度11%,准确性为90%。

表10:DBS-ELISA-ACPA盘中线性结果RA009样本*

讨论

比较ELISA-ACPA、DSS-ELISA-ACPA DBS-ELISA-ACPA平台

出于比较目的和新的DSS-ELISA-ACPA DBS-ELISA-ACPA平台,盘中和interday精密度和准确度ELISA-ACPA平台的决心图2和表1 - 3。在这个实验中,血清样本直接ELISA分析。正如所料,盘中OD数据的精度明显优于interday OD数据(图2)。然而,校准曲线拟合参数OD数据所示表2建议盘中的s形的整体形状和interday曲线是相同的。B参数表2相当于希尔系数并给出了配体结合的合作信息48]。注意,盘中和interday大约一B参数具有良好的精度,从约16 - 21%;这个结果表明抗原的抗体的亲和力不依赖于另一个抗原是否已经绑定到抗体。因为血清校准标准和血清样本受到相同的实验系统误差,精度和盘中的准确性和interday校准ACPA浓度水平是相似的(表3和4)。

DSS-ELISA-ACPA平台,血清样本首先应用于滤纸,然后提取滤纸,ELISA分析。盘中,interday精密度和准确度DSS-ELISA-ACPA平台的决心图4和表5和7。盘中OD数据的精度明显优于interday OD数据(图4)。比较ELISA-ACPA之间的OD数据精度和DSS-ELISA-ACPA平台(图2和4),有4倍的整体精度下降盘中OD数据和精度下降了三倍的DSS-ELISA-ACPA interday OD数据平台。这减少OD ELISA-ACPA之间的精度和DSS-ELISA-ACPA平台并不意外,可能是受到相同的系统添加实验产生的错误DSS-ELISA-ACPA,盘中精度和校准的准确性和interday ACPA ELISA-ACPA之间的浓度水平(表3和4)和DSS-ELISA-ACPA (表6和7)平台是相似的。

DBS-ELISA-ACPA平台,血清样本第一上升进入血液,然后应用于滤纸,然后提取滤纸,ELISA分析。盘中,interday精密度和准确度DBS-ELISAACPA平台的决心图6和表8 - 10。盘中OD数据的精度明显优于interday OD数据(图7)。比较DSS-ELISA-ACPA之间的OD数据精度和DBS-ELISA-ACPA平台(图2和4),盘中精度大约是相同的,而interday精度大约是DBS-ELISA-ACPA平台更好的2倍。它应该记住DSS-ELISA-ACPA OD数据收集10个月时间而DBS-ELISA-ACPA OD数据收集在一个两个月的时间。因此,观测精度应考虑初步的相似之处与不同之处。校准曲线拟合参数DBS-ELISA-ACPA OD盘中的数据表明,s形的整体形状和interday曲线相似(表8)。指出,盘中DBS-ELISA-ACPA平台B参数(1.231)在统计学上更大(p < 0.05)相比,盘中B参数ELISA-ACPA平台(0.969)(表2)。再次推断,有一个积极合作的建议绑定盘中DSS-ELISA-ACPA平台(48]。由于血清校准标准和血清样本受到相同DBS-ELISA-ACPA实验系统误差,校准盘中和interday ELISA-ACPA(之间的精密度和准确度表3和4),DSS-ELISA-ACPA (表6和7)和DBS-ELISA-ACPA (表9和10)平台都具有可比性。

实验误差在日常从滤纸抗体的提取效率。校准曲线拟合参数DSS-ELISA-ACPA OD盘中的数据表明,s形的整体形状和interday曲线又类似的(表5)。然而,它是指出B参数表5稍微增加相比,B参数ELISA-ACPA平台(表2)。然而,只有interday B参数DSS-ELISA-ACPA平台(1.427)在统计学上更大(p < 0.05)相比,interday B参数ELISA-ACPA平台(0.947)。这种积极增加希尔系数可能会建议积极合作绑定interday DSS-ELISA-ACPA平台;然而,需要更多的数据来建立这一点。由于血清校准标准和血清样本;

比较ELISA-ACPA和Anti-CCP2一组24人RA血清样本

ACPA浓度之间的相关性水平取决于ELISA-ACPA平台用于这项研究和anti-CCP2浓度水平中提供表124的RA血清样本(通过RA024 RA001)所示图8。很明显,有一种强烈的正/负相关性两个数据集。使用- RA截断值< 20 U /毫升ELISA-ACPA平台,RA005样品,RA006, RA008, RA012, RA015,并为RA RA019将被认为是负面的。使用- RA的截断值< 17 U /毫升anti-CCP2数据(49),样品RA005 RA008, RA RA012将被认为是负面的。因此,只有3(即。,RA006,RA015,和RA019)out of 24 samples produced mixed positive/ negative results. Since the assays used different antigens, the absolute antibody concentration could be considerably different between the assays.

比较DSS-ELISA-ACPA和Anti-CCP2一组24人RA血清样本

DSS-ELISA-ACPA之间有很强的正相关平台和anti-CCP2免疫测定(表1)24 RA血清样本(通过RA024 RA001)用于本研究。使用积极的RA的截断值> 20 U /毫升DSS-ELISAACPA化验和> 17 U /毫升anti-CCP2试验,观察到,21个样品24个样本的协议。剩下的3个样品RA005 RA008, RA012产生混合积极/消极的结果。

比较ELISA-ACPA和DSS-ELISA-ACPA平台的一组24人RA血清样本

ELISA-ACPA ACPA浓度水平测定,DSS-ELISA-ACPA平台24 RA血清样本(通过RA024 RA001)和5健康血清样本(通过HC030 HC026)。所示图7,这两个平台产生浓度数据是高度相关的。血清ELISA-ACPA和DSS-ELISA-ACPA平台之间的相关性非常高(r = 0.97, p < 0.0001)。一般来说,ACPA浓度水平的24 RA样品由DSS-ELISAACPA平台少,那些由ELISA-ACPA平台除了少数RA样本中含有低浓度水平的ACPA(即。、RA003-RA006 RA008和RA009)。示例RA012 ACPA以来特别有趣的浓度水平这不知什么原因的风险高,DSS-ELISA-ACPA平台相比ELISA-ACPA平台。5健康血清样本(通过HC030 HC026)显示ACPA浓度水平< 20 U /毫升为两个平台(数据未显示)。

因为所有来自RA样本病人被证实有RA和使用> 20 U /毫升ACPA阳性截止在RA患者,ELISA-APCA试验的能力正确识别RA患者(即。灵敏度)为75%,ELISA-APCA分析正确识别个人的能力没有RA(即。,特异性为100%。

结论

总之,DSS-ELISA-ACPA或DBS-ELISA-ACPA执行的方式符合ELISA-ACPA平台。因为只有24 RA样本用于验证DSS-ELISA-ACPA平台,新平台的临床相关的特异性和灵敏度不能确定在本研究。然而,数据表明,特异性和灵敏度的DSS-ELISA-ACPA平台(即类似于ELISA-ACPA平台。,sensitivity 60-80% and specificity 85-99%) and a negative RA cutoff value of <20 U/mL maybe reasonable for the DSS-ELISA-ACPA and the DBS-ELISA-ACPA platforms. Finally, there was a strong positive correlation between the ELISA-ACPA and DSS-ELISA-ACPA platforms (R=0.9873). The “gold standard” anti-CCP2 immunoassay for the 24 RA serum samples (RA001 through RA024) has the same high/low trend for the ELISA-ACPA and DSS-ELISA-ACPA platforms. The study suggests that a DSS- or DBS-ELISA-ACPA assay can be further developed as a reliable, economical and uncomplicated approach for clinical testing.

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