顶空气相色谱分离定量活性物质中残留溶剂方法的建立与验证

摘要

主要目的是开发并验证一种同时测定国际协调会议(ICH) Q3C指南中提到的9种残留溶剂的方法:甲苯、甲醇、乙醇、丙酮、2-丙烷醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷和乙腈。采用DB-624色谱柱(30 m × 0.53 mm, 1.8 μm)、氮气载气、火焰电离检测器进行色谱分离。对载气流量、烘箱温度和分流比进行了优化。我们选择了二甲基亚砜作为溶解溶剂。该方法具有良好的线性度、精密度、准确性和特异性，并应用于两种原料药中残留溶剂含量的研究和定量。取得了良好的效果。该方法操作简便，峰形对称，分辨率好，溶剂洗脱保留时间合理，在定量报告水平限至极限值120%范围内具有特异性、精密度和线性关系，相关系数大于0.999。使用乙酸正丁酯作为内溶剂，提高了线性度和精度，弥补了发生的变异性。两种原料药奈福泮和依诺肝素的残留溶剂水平的定量没有超过ICH指南规定的数量。因此，我们的方法可以应用于不同活性物质中残留溶剂水平的常规定量，为制药公司和研究实验室

关键字

气相色谱，残留溶剂，顶空，分析验证，火焰电离检测，分析方法，内部标准

简介

它们也用于生产线生产清洗和避免任何交叉污染。药品中的残留溶剂(RS)被定义为在活性物质或辅料的制造中使用或生产的有机挥发性化学物质，或在药品的制备中使用或生产的有机挥发性化学物质。它们在制药工艺的每个步骤(反应、分离和配方)中都是必不可少的，可以改善反应性能，并根据良好的生产规范生产活性物质的某些特性，如结晶形式、溶解度和纯度[1]。

然而，RS并没有被生产工艺完全消除，它们的痕迹可能残留在成品中，从而影响到药品的感官特征，如气味或味道，使患者感到不愉快，影响药品的有效性或治疗效果，影响药品的生物利用度、安全性和稳定性[2,3.]。此外，它们还可能加速产物的分解过程。

许多作者发表了关于药品多态性和RS对其形态影响的文章，如作为RS的三乙胺对三水氨苄西林稳定性和降解的影响[3.]。RS主要还干扰含有内容物的相互作用，例如构成热形成肺泡的塑化PVC(聚氯乙烯)的转移，或弹性体软木塞的添加剂[3.]。由于RS没有治疗益处，其中许多已知对人类和环境有害，因此应在制造过程结束时尽可能去除所有RS，以满足产品规格和良好制造规范。药品中杂质的控制是制药行业分析师的主要目标[4,5]。控制必须符合ICH Q3A (R2):新原料药杂质[6,7ICH Q3B:新药品中的杂质[8]。ICH已采纳RS杂质指南和每日接触限值(ICH指南Q3C) [9]。其目的是为患者的安全建议药物中可接受的RS量，表明使用毒性较低的溶剂，并描述被认为毒理学上可接受的水平。描述了四个不同的类别:已知会导致不可接受的毒性的溶剂(第1类)应避免在原料药、辅料或药品的生产中使用，除非其使用在风险-效益评估中可以得到充分证明;毒性较轻(2类)的溶剂应受到限制，以保护患者免受潜在的不良反应。理想情况下，应使用毒性较小的溶剂(第3类)。第4类包括未发现足够毒理学数据的溶剂。根据ICH指南，第1类溶剂需要进行识别和定量，第2类溶剂的单个限量应在50 - 5000ppm之间，第3类溶剂的含量超过0.5% (w/w)时必须进行识别和定量。最早发表在药典上的RS分析方法是失重法，方法简单，要求不高，但缺点很多，缺乏特异性，检出限高(约0.1%)，需要的样品量比较大(约1 ~ 2g)。气相色谱(GC)由于分离能力好，检出限低，由于有机溶剂的挥发性和毛细管柱的实质性分离能力，已主导了RS测定的分析方法。在气相色谱中，样品要么溶解在合适的溶剂中，要么直接注入[10,11]或通过顶空采样[12,13]。顶空采样是首选，因为它能够避免直接的液体或固体探测。在顶空采样中，复杂样品矩阵中的固体或液体样品矩阵中的液体或固体样品可以简化甚至消去其气相[14]。

欧洲专著第2.4.24章"残留溶剂的鉴定和控制" [15]介绍两套程序A及B，有助识别和量化RS。建议一般使用系统A，而系统B通常用于确认身份。两种系统均采用静态顶空气相色谱与火焰电离检测(FID)。

当没有关于样品中可能存在的溶剂的信息时，此通用方法可用于鉴定第1类和第2类RS;当在样品中检测到1类和2类溶剂时，作为极限测试;需要时用于3类溶剂的定量。

由于其有限的选择性和敏感性，这种通用方法的实施在制药行业是一个有争议的主题[16]。此外，一些技术问题的研究已经被注意到，例如，在分析N,N-二甲基甲酰胺中碱性化合物的盐酸时，会产生伪影[17]。此外，该通用方法虽然可以克服基质干扰，提高气相色谱分析的准确度和精密度，但不建议使用内标。内部标准有效地补偿了样品提取和注射过程中发生的变量，特别是复杂的样品制备过程[16,18,19]。此外，欧洲药典的通用方法需要很长时间才能实现对所有溶剂的满意分离。出于这个原因，制造商试图找到他们自己的方法，这将更快，更容易，并适用于他们的特定样品和分析物[16,20.]。一些作者开发了测定药物中RS的方法[21,22]。

本工作的目的是开发一种同时分离2类和3类活性物质中常用的9种RS的分析方法，采用顶空进样器，从欧洲药典推荐条件出发，通过优化几个参数，以提高分析性能，如分辨率、运行时间、精密度和准确度;然后对新方法进行验证，利用内标改进线性度和保真度判据;并将其应用于可能存在于原料药中的RS的研究和量化，如nefopam中的甲醇、甲苯水平;依诺肝素中的甲醇和乙醇含量。

实验

活性物质和试剂

依诺肝素和nefopam原料分别从TECHDOW(中国)和ISOCHEM(法国)采购。本研究中使用的溶剂和试剂均为分析级(HPLC级)。第2类和第3类溶剂，即甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲苯、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、丙烷-2-醇、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、乙酸正丁酯和二甲亚砜(DMSO)购自SIGMA ALDRICH(突尼斯)。

仪器:顶空气相色谱法

GC (AGILENT Technologies G1530A)配备了AGILENT 7694顶空注入器，并连接到FID。毛细管柱选用DB 624，柱长30 m，内径0.53 mm，膜厚1.8 μm (Agilent)。数据的采集和处理采用安捷伦ChemStation Software 3.2.1版本的计算机完成。其他使用的材料是天平(丹佛仪器SI-234)，玻璃器皿如容量双线移液器，烧瓶，烧杯和校准微量移液器。

一般程序

欧洲药典条件

在本研究中，选择欧洲药典中的系统A条件进行方法开发和验证(表1) [15]。

表1:欧洲药典条件(系统A)。

GC条件优化

建立了气相色谱-顶空进样器联用的方法，可同时研究和定量甲苯、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃等9种RS。我们已经开始遵循欧洲药典a系统的条件。由于得到的结果不够充分，例如运行时间长和分辨率差，我们开始优化载气流量、编程烤箱温度和拆分比。

标准及样品制备

将精确称重约0.5 g待分析活性物质溶解到安ilent公司制造的20 ml平底顶空GC小瓶中，加入5.0 ml溶液S2，然后密封小瓶，适当安装隔膜和压盖，制备浓度为0.1 g/ml的样品制备溶液S1。

内部标准溶液S2的浓度为0.2 mg/ml，通过在250 ml容量瓶中加入30 ml DMSO，并添加精确称重约50 mg的乙酸正丁酯，用DMSO完成标记。

将30 ml溶液S2放入100 ml量瓶中，加入精确称重约500 mg丙酮、500 mg乙醇、500 mg丙烷-2-醇、500 mg乙酸乙酯、300 mg甲醇、60 mg二氯甲烷、89 mg甲苯、41 mg乙腈和72 mg四氢呋喃，制得标准溶液S3。此标准溶液S3含有约0.5 mg/ml丙酮、0.5 mg/ml乙醇、0.5 mg/ml丙醇、0.5 mg/ml乙酸乙酯、0.3 mg/ml甲醇、0.06 mg/ml二氯甲烷、0.089 mg/ml甲苯、0.041 mg/ml乙腈和0.072 mg/ml四氢呋喃。与活性物质相比，这些量对应于欧洲药典的固定限量:5000ppm的丙酮、5000ppm的乙醇、5000ppm的丙烷-2-醇、5000ppm的乙酸乙酯、3000ppm的甲醇、600ppm的二氯甲烷、890ppm的甲苯、410ppm的乙腈和720 ppm的四氢呋喃[15]。

所开发方法的验证

根据ICH指南Q2 (R1)的要求，对各项参数进行验证[23-26]。

特异性和选择性

通过分析含有溶解溶剂和内标的空白溶液与含有DMSO稀释的九RS混合物的标准溶液(溶液S3)的选择性来确定。用各最近邻峰间的分辨率因子Rs来评价该方法的特异性。

线性

从标准溶液(S4)中120%的9 RS混合物中，通过级联稀释系列来确定线性。ICH Q2B规定了从定量限值报告水平到限值120%的最小线性范围[24]。本研究选择了六种浓度。我们通过相关系数R检验了本研究中提到的所有RS的线性关系²。

将30 ml S2溶液放入100 ml容积瓶中，准确加入600 mg丙酮、600 mg乙醇、600 mg丙烷-2-醇、600 mg乙酸乙酯、360 mg乙醇、72 mg二氯甲烷、106.8 mg甲苯、49.2 mg乙腈和86.4 mg四氢呋喃，制备120% (S4)的标准溶液。用S溶液稀释1/10²完成后，我们将2毫升该溶液移液到20毫升顶空GC小瓶中，并适当密封小瓶，配有隔片和卷曲帽。

精度

从S4溶液中加入0.5 g活性物质，在三种浓度水平(120%，100%和80%)下测定准确度。回收率的计算方法为发现的RS与引入的RS数量之比，即观测值与真实值的平均值。对nefopam和依诺肝素两种活性物质的准确性进行了检查，其中可能存在的RS为nefopam的甲醇和甲苯，以及依诺肝素的甲醇和乙醇。

精度

分析程序的精度表示在规定的条件下，从同一均匀样品的多次采样中获得的一系列测量值之间的一致程度(散射度)。精密度可分为三个层次:重复性、中等精密度和再现性。

分析方法的精度通常用一系列测量的方差、标准偏差(SD)或变异系数来表示。方法的精密度应通过测定参比溶液的六种不同制剂的含量来确定。中间精密度应通过研究用两种不同的设备或分析仪或天数分析的同质样品的测定方法的变化来确定。

在我们的研究中，通过对同一天和连续3天6次重复注射的药物溶液进行分析，建立了最需要的日内和日间精度标准。计算SD值和相对标准偏差(RSD)。

检测极限和定量极限

单个分析程序的检测限(LOD)是样品中分析物的最低量，可以检测但不一定可以量化为准确的量。定量限度(LOQ)是指分析物以可接受的精密度和准确度定量时的最低浓度水平[23]。

LOD和LOQ由响应的标准差σ(截距)和校准线的斜率[表示。27]。Kumar等人也使用了相同的统计数据[27]。一些作者选择基线噪声来估计这些极限[22,28,29]。

结果与讨论

分离条件优化

初步的经验

根据欧洲药典系统A条件获得的结果是不充分的，例如运行时间长(30分钟)和分辨率差(Rs<1)， THF和甲苯峰之间的洗脱时间损失约13分钟(图1)，优化后的方法可在短时间内使用内标对9种RS进行检测和定量，获得满意的分辨率。

选择列类型

在文献中，使用了许多固定相，如柱BP1(100%二甲基硅氧烷)[30.]， DB-FFAP(聚乙二醇改性为硝基对苯二甲酸)[27]， DB-WAXETR(聚乙二醇)[22]。在我们的研究中，经过多次试验，我们选择了具有欧洲药典相同特征的DB-624色谱柱，该色谱柱是专门为分析RS而设计的。该色谱柱有助于最佳分离，具有良好的分辨率(RS >2)。

溶解溶剂的选择

溶解溶剂的选择应谨慎，因为它影响到溶解的敏感性、平衡温度和时间。溶解溶剂应允许溶解许多样品;沸点高，稳定性可接受[21]。顶空注射器气相色谱分析中最常用的是水、DMSO、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、苄醇、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮，以及水/N,N-二甲基甲酰胺和水/DMSO的混合物[31]。水是溶解性物质的良好溶剂，水/N、N-二甲基甲酰胺和水/ DMSO混合物的使用提高了许多药物的溶解度，降低了物质的分配系数，促进了物质从液相向气相的转移。然而，如果药物的平衡温度接近溶剂的沸点，瓶中的压力就会危险地增加[21]如果选择水/N、N-二甲基甲酰胺和水/ DMSO的混合物，顶空注射器的平衡温度应低于100℃，导致沸点高的溶剂挥发性差。在我们的研究中，我们选择了DMSO，因为它的极性和溶解许多有机化合物的能力，低毒性，以及在高于100°C的高温下培养小瓶的可能性[32]。许多作者也使用DMSO作为溶解溶剂[27-29,32]。Siddiqui等人使用N,N-二甲基甲酰胺开发了一种控制多西他赛中9个RS的方法[22]。

内部标准的选择

内部标准品应具有与待测化合物非常相似的色谱行为，不干扰其他可能出现的物质，具有与检测系统相同的性质，并且具有高纯度。我们选择了乙酸正丁酯作为内溶剂，它属于第3类，在活性物质的合成过程中使用不多。它的使用纠正了顶空气相色谱法引起的变化。在文献中，Teglia等使用了四种内标:苯和三氯乙烯定量溶剂的下限，己烷和丙酮定量溶剂的上限[32]。Clécio已使用二恶烷作为内标，对七个RS进行分析[28]。然而，文献中有许多已开发的方法没有使用内部标准[22]。

载气流量优化

载气流量从2.1 ml/min (35 cm/s)降低到1 ml/min (19 cm/s)，改善了最近峰之间的分离。

优化拆分比例

分割比例在1/5和1/1之间变化。通过1/1的分割比例，我们得到了满意的灵敏度。

烘箱温度方案的优化

为了缩短分析时间，我们对烘箱温度程序进行了修改。参考以往文献的研究(表2)，经过多次温度变化程序的试验，我们选择了这个程序:40°C, 8 min，然后以10°C/min的速度上升到90°C，然后以40°C/min的速度上升到240°C，保持最终温度5 min。

表2:气相色谱(GC)条件的一些文献研究综述。

选择的条件

从以前的研究中，我们提出了气相色谱方法的程序，总结在表3。

表3:GC保留条件。

文中给出了在优化条件下分离9种RS的典型色谱图图2。良好的分辨率(Rs>2)，每个组分的对称峰形状和所有溶剂的合理保留时间都可以看到。

验证结果

特异性和选择性

乙酸正丁酯和DMSO的峰不干扰其他峰(图3)，且每个最近的峰值之间的Rs优于2 (表4)。

表4:同时分析了残留溶剂的保留时间、相对保留时间和溶解度。

线性

在不使用内部标准的情况下，标准R²>0.999并不适用于所有分析的RS，尽管在许多研究的文献中，R²>0.99被认为是可以接受的[29,32]。添加乙酸正丁酯后，各RS的浓度与峰面积之间均有良好的线性关系，在定量报告限值至极限值的120%范围内均为线性，相关系数大于0.999。在所有情况下，使用学生的t检验(α=0.05)认为截距可以忽略不计。

使用内部标准前后的统计结果见表5，很好地显示了内标对提高方法线性度的作用。

表5:RS校准曲线。

检测和定量的限度

LOD和LOQ的估计公式如下:Eq. (A1)和Eq. (A2)。

结果显示在表6。所获得的LOQ远远低于所分析RS的ICH规格，因此我们可以得出结论，我们的方法能够定量这些溶剂。

表6:以ppm为单位的检测和定量限度。

(A1)

(A2)

精度

日间精密度研究的精密度实验数据显示，% SD值小于5.0%，主要是在加入内标(表7)，证实该方法足够精确。对于日间精度，如果不加入内标，则该方法不精确(某些RS的RSD为>6%)(表8)，变异性较大，但加入内标后，% RSD值均小于6%，很好地说明了内标对提高方法精密度的作用。在文献中，可重复性的标准偏差因研究而异。

表7:日间精密研究。

表8:日间精确研究。

精度

采用如下公式计算各溶剂的回收率:式(A3)。

对两种活性物质nefopam和依诺肝素的准确性进行了检查，其中可能存在的RS为甲醇，甲苯用于nefopam，甲醇，乙醇用于依诺肝素。

计算每种溶剂的平均回收率(平均值±标准差)。的数据显示表9而且10，回收率在85% ~ 115%之间。

表9:奈福泮对RS的恢复研究。

表10:依诺肝素中RS的回收研究。

对于一些作者，已被接受的比例从90%到110%或80%到120%不等[27,29]。许多作者已经选择了学生测试统计，这是t_计算应该小于t_表格(28,29]。

我们可以得出结论，我们的方法能够以令人满意的精度量化RS极限。

应用程序

将所建立的方法应用于一些原料药中可能存在的RS的研究和定量。

nefopam的分析样品中不含甲醇和甲苯。得到的色谱图只显示了内标峰和DMSO峰。

依诺肝素样品的色谱图显示甲醇和乙醇的峰;它们的LOQ按公式Eq (A4)计算。

CSTD为标准溶液中溶剂的浓度(mg/ml);CE为所测溶液中活性物质的浓度(mg/ml);声发射是被测溶液中峰面积的比值;ASTD是标准溶液中峰面积的比值。

甲醇和乙醇浓度分别为42.35 ppm和41.92 ppm;这远远低于ICH指南规定的含量，分别为3000ppm和5000ppm。

结论

RS的存在在制药过程的每个步骤中都是必不可少的，由于RS没有治疗益处，因此控制和量化其在活性物质和成品中的限度是必不可少的，因为它们具有毒性，对人类和环境的有害影响，以及药品的有效性、生物利用度、安全性和稳定性。

ICH采用了RS杂质指南，其目的是为患者的安全推荐药品中可接受的RS量，说明使用毒性较低的溶剂，并描述被认为毒理学上可接受的水平。

欧洲药典采用了RS控制的参考方法，只允许对3类溶剂进行定量，因此开发其他内部方法并在用于常规控制之前进行验证非常重要。

在我们的研究中，我们开发并优化了一种分析方法，可以研究和量化2级和3级的9个RS水平。初步的经验选择了欧洲药典，由于得到的结果不够充分，如运行时间长，分辨率差，我们进行了优化。

所开发的FID气相色谱方法具有简单和选择性，峰形对称，各种溶剂保留时间良好合理，从色谱图可以看出，所有溶剂都在样品注入17分钟前洗脱。方法是特定的(Rs>2);精度(重复性SD<5%，中间精度RSD <6%);且在定量报告水平限值至限值的120%范围内呈线性，相关系数大于0.999。采用乙酸正丁酯作为内溶剂，提高了方法的线性度和精密度，弥补了方法中出现的变异。

将所建立的方法应用于奈福泮和依诺肝素两种原料药中RS水平的研究和定量。所获得的结果没有超过ICH指南规定的数量。因此，我们的方法可用于不同活性物质中RS水平的常规定量，适用于制药公司和研究实验室。

确认

作者对突尼斯Kalaa Kebira的联合国国际开发署实验室对该项目的支持表示感谢。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

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