产物的开发和验证方法,分析小说Self-emulsifying紫杉醇配方。

文摘

一个稳定的指示液相色谱法方法的开发和验证定量整除的体外药物释放和体外渗透研究紫杉醇新药物剂型。的反相高效液相色谱法分离是实现使用C18 LiChrospheriƒ¢100 (250 x4.6mm 5μm粒度)使用的流动相乙腈:水(比例v / v)在1.0毫升/分钟的流量。注射量是20μL洗提进行了分析和紫外探测器设置在波长227纳米。验证提出方法的特异性、线性精度、准确性和鲁棒性。紫杉醇被观察到的校准曲线的线性范围和r2 = 0.999 0.1 -100μg / ml。人们发现它很简单,具体,精确,准确、可再生的检测极限和定量0.026μg /毫升和0.085μg /毫升。该方法适用于发达紫杉醇制剂的质量控制、量化在压力条件下形成的药物及其降解产物以及其稳定性评估在加速条件下用于确定保质期。

关键字

紫杉醇,体外药物释放,体外渗透研究,稳定

介绍

紫杉醇(紫杉烷)tax-11-en-9-one 5β,20 epoxy-1 2α,4、7β,β,13α-hexahydroxy-4 10-diacetate-2-benzoate-13 -(α-phenylhippurate), (图1)是一种重要的抗肿瘤药分离紫杉树皮的杂草[1]。它是有效对抗多种人类癌症包括乳腺癌和卵巢癌(1,2]。这是亲脂性的日志(P 3.5),几乎不溶于水(0.3±0.02μg / ml),因此非常缓慢溶解率和口服生物利用度低(< 8%)3,4]。紫杉醇^®,当前销售肠外制定紫杉醇与病人的依从性差,严重过敏反应从血液循环和快速消除5,6]。Abraxane^®,另一个肠外制定紫杉醇是药物在人体白蛋白的胶态悬浮体。它不会造成过敏,但成本相对较高。相对于更高成本,Abraxane的功效^®只是边缘,因此缺乏病人的依从性(6]。

本研究项目的一部小说,紫杉醇的口服配方考虑其固有的问题,如水溶性差,低吸收到肠道内腔和高射流由于22运输车。该配方在本质上是self-emulsifying且容易封装了药物在nanocarrier立即接触胃肠道液。雷竞技网页版这部小说的脂质成分是制定使用生物相容性的表面活性剂肝类别。它可能会显示在无限稀释药物释放的变异与腔内液体。因此,它是合理的开发一个稳定指示简单,敏感,可再生的、经济和药物含量的精确估计方法存在的小说中使用的辅料配方。

尽管文献调查显示许多紫杉醇的方法分析生物体液毛细管电泳(7),但是8)和高效液相色谱法(9,10,11]。毛细管电泳和质方法分析紫杉醇是昂贵的,需要样品处理可能由于药物损失给出错误的结果。高效液相色谱法似乎是压倒性的选择分析但对紫杉醇,可怜的水溶解度导致可怜的洗脱通过列,因此产物似乎是一个经济和敏感的方法对其分析。

此外,紫杉醇的方法在文献报告估计制药剂型所示表1;要么使用较长的复杂的梯度系统分析同步估计的时间或者是有用的其他药物紫杉醇。这些方法的峰值低分辨率是不适合常规分析。这些报道的方法可能无法估计的低浓度紫杉醇的存在我们的配方辅料。这样一个简单的、敏感的、可再生的、经济和精确方法估计所需的药物含量配方。该方法被验证为每Q1A准则出具国际协调会议(我)24]。据报道,我们的方法是方便、有效的定量分析紫杉醇在存在不同的油、表面活性剂和助。也发现整除的具体和敏感分析体外药物释放,体外渗透研究和稳定性的评估优化self-emulsifying配方在模拟胃肠流体以及加速条件下。

材料和方法

材料

紫杉醇作为礼物示例提供了费森尤斯公司Kabi肿瘤学有限,印度。Caprylo己酰macrogol-8-glyceride Gattefosse提供的和甘油单油酸(圣牧师,Cedex法国)。聚氧乙烯失水山梨醇油酸酯(20),聚乙二醇,高效液相色谱级乙腈、甲醇、水和其他化学物质从默克公司购买(Schuchardh, Hokenbrunn,德国)。

方法

设备和色谱条件

日本岛津公司模型高效液相色谱配备第四纪LC-10AVP泵、变量波长可编程的紫外检测器,SPD-10AVP柱温箱(日本岛津公司),SCL-10AVP系统控制器(日本岛津公司),一个Rheodyne喷射器配备20μL循环和Class-VP 5.032软件被用于药物的常规分析。色谱法和反向C阶段了吗₁₈LiChrospher^®100 (250 x 4.6毫米,5μm粒度)列在环境条件。的流动相乙腈:水的流量优化1.0 mL / min。分析了注入成交20μL和洗提的波长227 nm,代表所有杂质的最大响应的波长。

股票的准备和工作的解决方案

紫杉醇的股票的解决方案是刚做好的紫杉醇的溶解10毫克2毫升容量瓶中乙腈,用了5分钟,然后成交与乙腈10毫升。标准储备溶液的浓度是1000μg /毫升。此外,1毫升1000μg原液/毫升摄于容量瓶和体积是10毫升与流动相乙腈:水混合物(50:50 v / v)使工作溶液浓度100μg /毫升。这是用于获得后续稀释的方法验证和稳定性研究。超声波浴中的所有样本均质,0.22μ过滤膜过滤和分析前转移到液相色谱瓶。

制备校准标准

浓度范围的校准标准准备0.1 -100μg /毫升的分析。校准标准浓度的0.1、0.5、1、5、10、25、50、75μg / ml被稀释准备0.01,0.05,0.1,0.5,1,2.5,5,7.5毫升的工作溶液浓度100μg /毫升10毫升容量瓶中流动相。

制备self-emulsifying口服配方

紫杉醇加载self-emulsifying口服配方制定使用水滴定法(25]。不同配方的组件(比如油、表面活性剂和助筛选的基础上最大的紫杉醇溶解度和他们的比例是通过建设pseudo-ternary进一步优化相图(26]。紫杉醇包含surfactant-co石油解决方案添加表面活性剂系统连续搅拌和涡流搅拌,直到混合物各向同性成立。制定受到体外通过溶解药物释放装置,通过翻转肠囊体外肠道运输。整除收集在不同的时间间隔使用提出验证方法为药物的内容进行了分析。

方法验证

按照我方法验证指导(24,27,28)等不同的参数线性、准确性、精密度、检测极限(LOD),量化的限制(定量限)和鲁棒性。线性的方法建立了注入准备校准标准的药物浓度范围的0.1μg ml-1 100μg ml-1。分析了每个解决方案一式三份注射20μL的解决方案。盘中精度建立了药物分析解决方案(10、15和200μg ml-1)一式三份的同一天。inter-day精度的方法是由重复的研究在三个不同的日子。%计算相对标准偏差值来确定盘中,inter-day精度。提出了分析方法的准确性是评价通过添加三个已知的药物浓度(50%、100%和150%)preanalyzed样品和确定的复苏药物补充道。实验进行了一式三份。该方法的鲁棒性是由各种不同的色谱流动相组成和流量等参数来确定他们的影响力定量分析。检测极限(LOD)和量化的限制(定量限)测定使用校准曲线的斜率(S)和标准差(SD)的空白样品使用公式

分析了每种药物方案一式三份。所有数据是评估使用标准统计软件包为Windows和GraphPad Prism 4.0(美国GraphPad软件有限公司)。统计学意义被认为在95%概率水平(p < 0.05)。皮尔森相关系数(r)被用来评估相关的意义。

强制降解研究

不同压力条件下应用紫杉醇的稳定性评估包括:

碱降解

示例解决方案碱降解研究紫杉醇的准备在1:1的甲醇和0.1 n氢氧化钠。混合物被保持在80°C水浴30分钟。解决方案被允许获得环境温度和合成解决方案100μg /毫升浓度分析方法。

酸降解

示例解决方案的酸降解研究紫杉醇在1:1盐酸甲醇和0.1 n的混合物。混合物被保持在80°C水浴30分钟。解决方案被允许获得环境温度和合成解决方案100μg /毫升浓度分析方法。

氧化研究

示例解决方案氧化研究紫杉醇的准备在1:1的甲醇和3% H₂O₂。混合物被保持在80°C水浴30分钟。解决方案被允许获得环境温度和合成解决方案100μg /毫升浓度分析方法。

干热的研究

紫杉醇粉被暴露在干热(80°C)对流烤箱8 h。然后准备的解决方案是在甲醇-水1:1比例获得100μg /毫升浓度和分析方法。

紫杉醇粉被暴露在紫外光范围320 - 400 nm 8 h来确定光辐照的影响在固态紫杉醇的稳定性。暴露粉末制备的解决方案在1:1的甲醇-水混合物获得100μg /毫升浓度和方法进行了分析。

稳定的解决方案

药物在溶液的稳定性分析是由样品的重复分析实验过程中在同一天同时药物解决方案的存储后48小时在实验室条件下(25±2°C)和制冷(8±0.5°C)。

稳定模拟胃肠道液

自乳化配方稀释到10% (v / v)和孵化的力量在模拟胃液体37°C(山东)的pH值1.2和模拟肠道流体(SIF)的pH值7.4,准备按照USP规范(29日)来估计这些液体的体内药物含量。整除的这些解决方案都用移液器吸取到玻璃管时间点0,15日,30和60分钟胃稳定性研究和(0,1,2和3 h的肠道稳定性研究一式三份。之后,样本离心机然后用流动相稀释50倍到10μg /毫升浓度,然后过滤在高效液相色谱分析。之间的相对差异(RD)紫杉醇的数量增加和产物,提出量化方法潜伏期结束时计算如下:

应用程序的方法

紫杉醇溶解度在药用辅料

发展self-emulsifying口服配方,紫杉醇溶解度测定在不同配方辅料如油、表面活性剂和助筛选。经过平衡溶解度的紫杉醇在不同的辅料,上层清液离心后分离,并溶解在甲醇(26]。产物溶解药物被提出量化方法。

体外释放的紫杉醇自乳化配方

紫杉醇体外释放溶解媒体酸碱1.2和7.4是使用透析袋技术(26,30.使用USP溶解装置II)。开发的配方是放置在一个透析袋包含2毫升的解散媒体和被拴牢,把溶解装置。0.5毫升的溶解样品被撤回以固定时间间隔8小时,是药物分析内容提出反方法。这项研究是在一式三份和完成体外解散的开发制定与水中悬浮体的纯药物控制。

来自体内的肠道运输的紫杉醇自乳化配方

紫杉醇体外肠运输研究是由翻转肠囊法(31日,32]。翻转囊的白化只wistar大鼠回肠准备使用Kooshapur和Chaideh[描述的方法33]。50毫升的膨胀内脏囊被磷酸缓冲盐(PBS)的pH值7.4包含10μM紫杉醇,并保持在37±0.5°C。PBS的囊充满了2毫升。200年μl囊内的样品溶液中得到的定量的紫杉醇渗透每15分钟到90分钟的研究34]。这项研究是一式三份和体外肠渗透的发展制定与纯药物控制的解决方案。

加速稳定性分析

自乳化配方受到稳定性分析根据协议由伊凡娜等,2006年,制定的副本保存在加速条件下的温度。副本存储在30±2°C / 75±5%, 40±2°C / 75±5% RH和50±2°C / 75±5% RH (35)使用稳定室维护所需的湿度。副本的配方被置于稳定的房间;样本撤回的时间间隔0,30、60、90天,分析药物百分比保持适当的稀释后的配方与流动相。药物降解,在每个时间间隔计算剩余量。退化的顺序是由图解法。降解速率常数(K_度奇遇记》)立志在每个温度之间使用图形绘制日志%剩余药品和时间(没有显示)。阿伦尼乌斯图之间构建日志K_度开尔文温度的倒数(1 / T)。降解速率常数的值25°C (K₂₅)是通过外推的阿伦尼乌斯情节和保质期就用K计算₂₅在给定的方程:

T_0.9= 0.1052 / K₂₅(1)

结果与讨论

优化的色谱条件

不同溶剂系统尝试发展的合适的rp方法量化的紫杉醇原料药、制药辅料和发达的配方。流动相的选择是基于灵敏度、易于制备、药物内容的可用性和适用性评估。紫杉醇是高度溶于常见的反相高效液相色谱流动相溶剂,如甲醇/水和乙腈/水系统。但发现甲醇在流动相高压导致的问题,因此选择乙腈。经过几次的初步调查色谱运行不同的乙腈/水系统的构成从40:6 0到80:20反之亦然,组成的流动相乙腈:水,则v / v进行优化1毫升/分钟的流量进行进一步的研究。在描述实验条件下,山峰都是定义良好和自由从尾矿(图2)和被紫外检测器检测到设定在227 nm (图3)。保留时间是7.5±0.05分钟。优化的工艺参数所示表2。

验证的方法

线性

线性研究验证该方法能够分析样品溶液的浓度范围中分析物的响应是线性与浓度成正比。这是由准备校准标准和分析进行了一式三份。地区之间的校准曲线峰值与浓度是线性的。校准曲线线性回归数据显示良好的线性关系对峰面积。线性回归方程被发现y = 34252 x + 48913年回归系数(R2) 0.999所示图4。皮尔逊相关系数(r)是0.9994,95%置信区间0.9986 - 0.9997,表明极显著线性相关(P < 0.0001)。相对标准偏差(%相对标准偏差)的斜率不同的三天是0.176%。这表明没有显著差异在山坡上的校准块准备在不同的日子(P > 0.05)。

精度

一个分析方法的准确性是该方法获得的试验结果的亲密是真实值样本。它表示为%复苏,这是由标准添加法决定。pre分析样本注入额外的50,100和150%的标准,然后混合三个分析方法来确定药物的数量恢复。该方法经济复苏的99.50 - 100.73%,飙升的额外标准药物解决之前分析测试解决方案。所示的结果表3和低%相对标准偏差值表明,目前的方法是准确量化的紫杉醇。

精度

分析方法的精度是亲密的程度决定复制同质样本的价值。精度是在两个级别的我建议即重复性和中间精密度。重复性或盘中精度进行了三个浓度水平10μg /毫升,15μg /毫升,20μg /毫升一式三份。,中级精度或interday精度是由分析相同浓度的一式三份样品连续超过三天。重复性和中间精度的结果表达的%相对标准偏差和所示表4。较低的值% RSD(< 2%)表示该方法的可重复性。

检测和定量的极限

LOD和定量限测定的标准偏差的方法。这个参数的测定空白样本注入一式三份。LOD和定量限被发现是0.026μg分别/毫升和0.085μg /毫升,这表明足够的灵敏度的方法。因此该方法可用于检测和定量的紫杉醇即使在非常低的浓度。

鲁棒性

这个参数的影响进行了分析评估一个小但故意变化测定紫杉醇色谱条件。它决心通过引入小流量的变化(0.8和1.2毫升/分钟)和流动相的组成(±2%)。

保留时间没有明显变化的紫杉醇通过改变流动相的组成和流量。% RSD(< 1%)的低价值获得后引入小流动相组成和流量的变化表示方法的鲁棒性所示表5。

强制降解研究

确保方法的特异性和该方法的评估stability-indicating属性,紫杉醇粉末是强调在不同的条件下。散热的,光解的酸/碱性水解和氧化降解是由公开解决紫杉醇80°C,紫外线(320 - 400海里),0.1 M盐酸,0.1 M氢氧化钠和3% H₂O₂。

强制降解研究的结果表示该方法的高度特异性的紫杉醇。典型的色谱分析后得到强调紫杉醇所示的解决方案图5。紫杉醇的解决方案(100μg /毫升)存储在冰箱里被用作控制样本比较的目的。紫杉醇控制样品的峰保留时间为7.5分钟。暴露在酸水解、氧化降解温度升高80°C或暴露于紫外线照射,紫杉醇保留时间大约是7.5分钟在每种情况下药物浓度为72.83±0.30μg / mL,μg /毫升91.75±0.52,99.10±0.26μg /毫升和98.46±0.20μg /毫升分别如图所示表6。这是发现紫杉醇在固态热和光解的压力条件下是稳定的。然而在接触碱性水解,多云的凝胶在紫杉醇的解决方案。导致色散是使用0.22μm过滤膜过滤和滤液药物含量的分析方法。它被发现是10.33±0.48μg /毫升。

紫杉醇的结构所示图1说明了酯附件紫杉醇侧链的三环(baccatin)核心以及各种网站二萜乙酰化作用的核心。所示图5(C)、水解碱性紫杉醇的解决方案导致的快速形成几个降解。三个早期淋洗降解和一个迟洗脱降解形成紫杉醇在接触的基本条件。早期的洗脱顺序三个洗脱降解表明他们是亲脂性的比紫杉醇。基于紫杉醇的结构,良好的化学过程的基本条件包括水解酯的联系。然而,基于紫杉醇的结构,一个化学过程与酸性环境下需要添加水紫杉醇核心,可能通过打开的oxetane戒指。前两个主要降解产物筛选了紫杉醇,表明他们的极性特征与紫杉醇所示图5 (B)。基于观察到的最小的退化与酸性条件相对苛刻,紫杉醇在酸性环境中似乎相当稳定。只有一个小观察降解淋洗紫杉醇治疗前与过氧化氢溶液中所示图5(一个)。这有辱人格的产品具有相同的相对保留时间如前所观察到的酸和碱降解样品。因此,可能的降解产物可以阐明其色谱相对保留时间的基础上,提出使用高效液相色谱方法。可能的降解产物形成在接触碱性水解包括侧链甲基酯,baccatin三世,10-deacetylpaclitaxel, 7-epipaclitaxel。在酸性水解,可能的降解产物形成10-deacetylpaclitaxel和oxetane环打开产品。然而,治疗只有10-deacetylpaclitaxel过氧化氢生产。各种降解产物出现在不同的压力条件下相对保留时间(RRT) 0.19(侧链甲基酯),0.26 (baccatin III), 0.55 (10-deacetyl紫杉醇),0.81 (oxetane环打开)和1.21 (7-epipaclitaxel)所示图5。固体药物的暴露干热和光解的强调条件并不导致显著的分解。它表明,紫杉醇在固态热和光解的压力条件下是稳定的。

本研究的目的是确定药物降解产物,但不仅表明,提出的方法是具体的和不干涉,如果存在降解产物在加速稳定性研究的样本。

稳定的解决方案

药物的解决方案被发现是稳定的48小时在实验室温度下(25±1°C)和制冷(8±0.5°C) acetonitrile-water(比例% v / v)色谱显示没有峰值对应的降解产物也没有显著改变紫杉醇的峰面积响应。此外,通也证实药物溶液的稳定性没有区别在光谱的形状和λmax存储之前和之后的示例所示图3。

稳定模拟胃肠道液

它可以测量任何程度的降解的药物在胃肠道的存在流体。退化的程度或损失的药物在山东孵化后或SIF被药物浓度的量化评估方法的培养时间。紫杉醇的相对偏差(%)在山东和SIF没有大于1.27%和1.03,分别。因为药物物质的暴露在37°C到山东(1 h)或SIF (3 h)模仿体内药物接触这些液体,这是认为紫杉醇胃肠道环境中保持稳定发展药物载体。雷竞技网页版

应用程序的方法

在制定辅料紫杉醇溶解度

紫杉醇溶解度不同药物赋形剂用于发展self-emulsifying口服配方方便量化和结果所示表7。紫杉醇色谱的估计不同药用辅料和开发配方中所示图6。之间没有交互观察药物和辅料自乳化配方中,证实了该方法的特异性。

体外释放的紫杉醇自乳化配方

紫杉醇体外释放在解散媒体酸碱1.2和7.4是量化的使用方法。的体外解散的紫杉醇是绘制%累积量的药物释放轴和时间轴。配置文件所示图7。该方法被发现敏感分析药物的低浓度(< 10μg /毫升)。

体外肠渗透的紫杉醇自乳化配方

产物紫杉醇体外肠运输使用提出量化方法。紫杉醇渗透——累积紫杉醇渗透和时间之间的时间剖面绘制和所示图8。该方法似乎分析摩尔(nM)浓度的药物被吸收腔。

加速稳定性分析

加速稳定性研究的结果说明紫杉醇在每个温度的缓慢降解,表示相当稳定的50毫克紫杉醇加载在发达自乳化配方。退化的顺序是由图解法在每个温度下一级动力学。因此,日志%药物剩余的绘制与时间和降解速率常数(K_度)计算曲线的斜率在每个温度所示表8。一级动力学数据符合阿仑尼乌斯方程:

K是速率常数,一个频率因素,Ea活化能,R气体常数(1.987大卡/ K /摩尔)和T的绝对温度。此外,日志K之间的阿伦尼乌斯的阴谋_度值与互惠的温度(1 / T×10³)在°K被发现线性加速稳定性研究的温度范围内选择。动能的紫杉醇在自乳化配方在室温(25±2°C)决心所示表9。阿伦尼乌斯的阴谋,降解速率常数25°C (K₂₅)确定和发现是1.2571×10⁴天¹。此外,保质期紫杉醇在发达self-emulsifying配方计算用方程1中也被发现是2.29年。

结论

产物一个方便和快速的定量方法提出了基于在药用辅料用于紫杉醇脂质自乳化配方。体外药物释放和肠道运输从self-emulsifying紫杉醇口服配方使用该方法准确地量化。给出的方法似乎是经济和更好的复苏药物干扰赋形剂的存在。发达的口服配方self-emulsifying紫杉醇整个分析发现是稳定的温度和湿度条件。因此,该方法可用于常规质量控制分析紫杉醇在lipid-surfactant基础配方的开发。

Acknowlegement

作者感谢大学拨款委员会,印度政府资助项目的工作,也感谢Gattefosse与日光化学表面活性剂和油样品提供礼物。作者表达自己特别感谢费森尤斯公司Kabi肿瘤学有限,印度提供样本紫杉醇作为礼物。

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