反相高效液相色谱法同时测定阿托伐他汀钙和雷米普利片剂含量的建立与验证

摘要

摘要目的:建立了反相高效液相色谱法同时测定阿托伐他汀钙和雷米普利含量的新方法。

方法:色谱采用phenomenex luna C18色谱柱(250 × 4.6 mm, 5μm)，流动相为甲醇，磷酸摇床(0.1% v/v三乙胺pH 4.5，与0.1% v/v正磷溶液平衡)，流速为1 ml/min，使用waters高效液相色谱自动进样器，分离模块2695高效液相色谱系统，PDA检测器，波长254 nm。运行时间12分钟。

结果:阿托伐他汀和雷米普利的滞留时间分别为3.02和6.10 min。阿托伐他汀和雷米普利的浓度分别在20 ~ 70 μg/ml和20 ~ 70 μg/ml范围内，线性相关系数为0.999。为了准确性，阿托伐他汀和雷米普利的总回收率分别为99.8%和99.8%。阿托伐他汀的LOD和LOQ分别为2.95和9.96。拉米普利的LOD和LOQ分别为3.34和10.05

结论:研究结果表明:RPâ′高效液相色谱法简便、准确、精密度、坚固性、鲁棒性、快速、重现性好，可用于阿托伐他汀钙和雷米普利片剂含量的常规测定。

关键字

大肠杆菌，生物传感器，甘油，适应性实验室进化，l -丝氨酸

简介

阿托伐他汀(立普妥®)是一种降脂药物，包括在他汀类药物。他汀类药物通过抑制肝脏内胆固醇的内源性产生，降低异常胆固醇和血脂水平，最终降低心血管疾病的风险。更具体地说，他汀类药物竞争性地抑制羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶，该酶催化HMG-CoA转化为甲丙酸[1］．这种转化是一种关键的代谢反应，涉及到几种与脂质代谢和运输有关的化合物的产生，包括胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)(有时被称为“坏胆固醇”)和极低密度脂蛋白(VLDL)。IUPAC名称双((3R,5R)-7-[2-(4-氟苯基)-3-苯基-4-(苯基氨甲酰)-5-(丙烷-2-基)- 1h -吡咯-1-基]-3,5-二羟基庚酸钙)。化学式C₆₆H₆₈CaF₂N₄O₁₀．分子量1155.34。阿托伐他汀(钙盐水合物)可溶于有机溶剂，如乙醇、二甲基亚砜(DMSO)和二甲甲酰胺(DMF)，应用惰性气体清洗。阿托伐他汀(钙盐水合物)在这些溶剂中的溶解度分别约为0.5、15和25 mg/ml。

雷米普利是一种前药，属于血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂类药物。它在肝脏代谢为雷米拉西特，在较小程度上，肾脏代谢为雷米拉西特。Ramiprilat是一种有效的、竞争性的ACE抑制剂，ACE是一种负责血管紧张素I (ATI)转化为血管紧张素II (ATII)的酶。ATII调节血压，是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的关键成分。雷米普利可用于高血压、充血性心力衰竭、肾病的治疗，并可降低心血管事件高危人群的死亡率、心肌梗死和中风[2］．IUPAC名称(2S,3aS,6aS)-1-[(2S)-2-{[(2S)-1-乙氧基-1-氧-4-苯基丁烷-2-基]氨基}丙基]-八氢环戊[b]吡啶-2-羧酸。化学式C₂₃H₃₂N₂O₅．分子量416.58。雷米普利可溶于有机溶剂，如乙醇、DMSO和二甲基甲酰胺(DMF)，应用惰性气体清洗。雷米普利在乙醇中的溶解度约为25 mg/ml，在DMSO和DMF中的溶解度约为30 mg/ml (图1而且2）.

文献调查显示，文献中很少报道用反相高效液相色谱法分析阿托伐他汀钙和雷米普利单独或与其他药物合用纯形式和药物制剂的方法[2-7]， rp-lc [8］．针对同时测定片剂剂型阿托伐他汀钙和雷米普利含量的常规分析需要一种合适的、具有成本效益的RP-HPLC方法，尝试开发简便、精确、准确、经济的阿托伐他汀钙和雷米普利含量的分析方法。所提出的方法将根据ICH指南进行验证。本工作旨在建立一种简便、灵敏、准确、经济的反相高效液相色谱法同时测定阿托伐他汀钙和雷米普利片剂含量的新方法并进行验证。根据ICH指南验证所开发的方法用于预期的分析应用，即应用所建议的方法分析其剂型的药物。目的:应用所建立的方法同时测定阿托伐他汀钙与雷米普利片剂的含量。

材料与方法

化学品和试剂

阿托伐他汀钙和雷米普利购自gland pharma india limited。NaH2PO4的分析级由finerchem limited、正磷酸(Merck)、水和甲醇(Lichrosolv (Merck)提供。

仪器和色谱条件

色谱是在Waters 2695 HPLC系统上进行的，该系统配备了自动进样器、紫外检测器和empower 2软件。色谱柱对称为c18 (4.6 × 150 mm, 5 μm)，波长为274 nm，尺寸为25℃。优化后的流动相为pH为2.5的磷酸钠缓冲液和20∶80的乙腈。流速保持在1 ml/min，运行时间为12 min。

溶液的制备

缓冲液的制备:将1.3克正磷酸二氢钾精确称量溶解于500ml水中，用正磷酸调节pH-2.6，在超声波水浴中脱气10分钟，真空过滤下经0.45 μ过滤器过滤。

流动相制备:将精确测量的200 ml甲醇和800 ml水在超声波水浴中混合脱气10分钟，然后在真空过滤下通过0.45 μ过滤器过滤。

稀释剂:流动相被用作稀释剂。

标准原液的制备:准确称出阿托伐他汀10 mg和雷米普利10 mg工作标准品，转移到100 ml清洁干燥的量瓶中，加入少量稀释剂并超声使其完全溶解，用相同的溶剂(原液)使体积达到标记。进一步将1.5 ml上述原液移液至10ml容量瓶中，用稀释液稀释至标记处。

样品原液的制备:准确称量并将相当于25 mg阿托伐他汀和25 mg雷米普利样品转移到100 ml清洁干燥的量瓶中，加入少量稀释液并声纳使其完全溶解，并用相同的溶剂(原液)使体积达到标记。进一步将0.1 ml以上原液移液至10ml容量瓶中，用稀释液稀释至标记处。

过程:将20 μL标准液和样品液注入lc系统，测定阿托伐他汀和雷米普利的峰面积。

方法

根据ICH指南，对所开发的色谱方法进行了系统适用性、线性精度、精密度、坚固性和鲁棒性验证。

系统适宜性参数:为了评估系统的适宜性参数，如保留时间、尾砂因子和USP理论板计数，允许流动相以1.0 ml/min的流速流过色谱柱12分钟，使色谱柱在环境温度下达到平衡。将20 μL的标准品注入phenomenex luna C18 (250 × 4.6 mm, 5μm)中进行色谱分离，并以1.0 ml / min的流速使磷酸床和甲醇组成的流动相流过色谱柱。所开发方法的保留时间、尾砂因子和USP理论板数示于表1．

药剂配方测定:该方法成功地应用于阿托伐他汀和雷米普利片剂的含量测定。阿托伐他汀和雷米普利的结果与相应的标签量相当，并显示在表2．

分析方法的验证

线性和范围:将适量阿托伐他汀溶解于7 ml稀释液中制备原液，用稀释液进一步稀释至所需浓度。阿托伐他汀浓度为800 μg/ml ~ 2400 μg/ml，雷米普利浓度为30 μg/ml ~ 60 μg/ml。将每个能级注入色谱系统，测量峰面积。绘制峰面积与浓度的关系图(x轴浓度和y轴峰面积)并计算相关系数。结果显示在表3．

精度的研究:准确度通过恢复研究确定。回收方法分别在50%、100%、150%三个水平进行。将标准溶液注入色谱系统。计算阿托伐他汀和雷米普利的发现量和添加量，并计算个人恢复和平均恢复值。结果显示在表4而且5．

精密的研究:通过6次重复注射标准品的方差系数计算精密度。将标准溶液注射6次，并在HPLC中测量所有6次注射的面积。确定了6次重复注射面积的%RSD。结果显示在表6而且7．

强度:为了评价该方法的中间精密度，在不同的日子进行精密度测试。将标准溶液注射五次，并在HPLC中测量所有五次注射的面积。确定了5次重复注射面积的%RSD。结果显示在表8而且9．

鲁棒性:作为鲁棒性的一部分，故意改变流速、流动相组成、温度变化来评估对方法的影响。流速变化为±0.1 ml/min。结果显示在表10而且11．

LOD和LOQ:采用定量限(LOD)和定量限(LOQ)测定RP-HPLC的灵敏度。根据ICH指南，使用以下公式从校准曲线计算。结果显示在表12．

LOD=3.3 σ/S和
LOQ=10 σ/S，其中
σ=回归线y截距的标准差
S=校准曲线的斜率

结果与讨论

表1。系统适宜性参数。

表2。雷米普利和阿托伐他汀检测结果。

表3。雷米普利和阿托伐他汀呈线性。

表4。显示了雷米普利的准确性结果。

表5所示。显示阿托伐他汀的准确性结果。

表6所示。雷米普利的精密度结果。

表7所示。阿托伐他汀的精密度结果。

表8所示。雷米普利和阿托伐他汀加固结果。

表9所示。雷米普利和阿托伐他汀加固结果。

鲁棒性结果

表10。雷米普利和阿托伐他汀的流量变化结果。

表11所示。流动相构型(有机相)不一致影响的结果。

表12。阿托伐他汀和雷米普利的LOD和LOQ。

结论

该方法简便、准确、灵敏，可用于同时测定阿托伐他汀和雷米普利的剂型。因此，该方法可简便易行地用于阿托伐他汀和雷米普利纯制剂及其药物剂型的常规质量控制分析。

参考文献

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