药学与药学研究与评论“雷竞技苹果下载，
菜单e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
年代Dhruvi＊B Ankita和P Bhagirath
萨特凯瓦尔药学院，萨萨-388365，塔塔。印度古吉拉特邦阿南德地区。
收到日期:13/02/2014接受日期:17/03/2014修订日期:12/03/2014
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一种简单、快速、精确的反相高效液体色谱法采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，采用BDS hypersil C18色谱柱同时测定对乙酰氨基酚和帕马布隆的原料药剂型和合用剂型。以磷酸缓冲液(pH-4):甲醇(65:35v/v)为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为270 nm。对乙酰氨基酚和帕马布隆的保留时间分别为4.04 min和7.36 min。对乙酰氨基酚在32.5 ~ 97.5μg/ml范围内线性良好，帕马布隆在2.5 ~ 7.5μg/ml范围内线性良好。根据国际会议协调(ICH)指南，对该方法的准确度、精密度、线性度、检测限、定量限和稳健性进行了验证。
开发，验证，对乙酰氨基酚(PCM)，帕马布隆(PAM)
扑热息痛(N- 4-羟基苯乙酰胺)是一种镇痛解热药，抗炎作用较差，属于对氨基酚类非甾体抗炎药衍生物。对乙酰氨基酚的主要作用机制被认为是抑制环加氧酶(COX)。最近的研究结果表明，它对COX-2具有高度选择性，因为它对COX-2具有选择性，因此它不会显著抑制促凝血栓素的产生[1］．
帕马布隆是一种利尿剂，可增加尿流率;然而，临床上有用的利尿剂也会增加钠离子(钠尿)和伴随的阴离子(通常是Cl-[)的排泄率。2］．
对乙酰氨基酚帕玛布隆片用于经前焦虑症、背痛、经前综合症[3.］．
分析方法开发定义为开发、修订和应用经过验证的、标准化的和官方的分析方法[4］．方法验证是记录或证明所选方法为预期用途提供分析数据的过程。采用精度、精密度、线性度、检出限、定量限、系统适用性、选择性和特异性等参数对方法进行验证[5，6］．
对乙酰氨基酚是印度药典、英国药典和联合药典的官方名称。帕玛布隆是联合药典的官员。目前报道的对乙酰氨基酚和帕马布隆联合用药剂型中含量的分析方法很少。
paracetamol和pamabrom的联合配方已于2011年12月7日获中央药物标准控制组织(CDSCO)批准[7］．
图1:扑热息痛的化学结构[6］
图2:帕玛布隆的化学结构[9］．
采用高效液相色谱级水、甲醇和乙腈制备流动相。用二磷酸氢钾(AR级)和邻磷酸(AR级)制备缓冲液。对乙酰氨基酚和帕马布隆的纯样品是由阿斯特龙化学品，阿默达巴德和Ami生命科学私人有限公司，瓦多达拉赠送的。MENSODOLTM TAB (paracetamol-325mg, pamabromm -25mg)是金奈Anthus制药公司的礼物。
HPLC体系为SPD-20AT, Shimadzu由泵LC-20AT、检测器SPD-20AT、色谱柱BDS hypersil C18、250mm × 4.6mm、5μ(粒度)、Thermo scientific、注射器流变注射器(20 μl容量)、注射器hamilton (25 μl容量)组成。使用色谱软件Spinchrom对数据进行处理。
新配制的磷酸盐缓冲液(pH-4):甲醇(65:35v/v)的混合物用作流动相。流动相经0.45μm滤膜过滤，使用前进行声波处理。流动相流速维持在1.0 ml/min。
将350 ml甲醇与650 ml磷酸盐缓冲液(pH: 4.0)混合制备流动相，经0.45μm whatman过滤器过滤，超声10 min。
参考标准品PCM 65 mg和PAM 50 mg分别转移到10 ml容量瓶中，溶解于甲醇中。摇瓶20 min，使体积达到流动相标记，得到PCM (650μg/ml)和PAM (500μg/ml)的标准原液。原液经0.45μm whatman滤波器过滤。取1ml PAM溶液至10ml容积瓶中，稀释至流动相标记处，得到PAM工作标准溶液(50μg/ml)。以适当比例的原液配制了PCM和PAM的工作标准溶液。
称量20片，确定平均重量，最后制成粉状。然后将精确称重的片剂粉末(相当于650毫克PCM和50毫克PAM)转移到装有5毫升甲醇的10毫升体积瓶中，超声20分钟。用whatman滤纸过滤溶液，并将体积调整到带有流动相的标记。该溶液的PCM含量为650μg/ml, PAM含量为50μg/ml。将该溶液(0.5 ml)转移到10ml的容量瓶中，并将体积调整至标记为流动相，以得到PCM (32.5μg/ml)和PAM (2.5μg/ml)的浓度。
以甲醇为空白，PCM (32.5μg/ml)和PAM (2.5μg/ml)标准溶液在200 ~ 400 nm范围内扫描，记录重叠光谱。PCM和PAM的分析波长为270nm。（图3)．
图3:检测波长的选择(270 nm)。
将PCM (32.5μg/ml)和PAM (2.5μg/ml)的纯药物溶液分别注入HPLC体系中，分别在甲醇、水:甲醇、水:乙腈、磷酸盐缓冲液:甲醇、磷酸盐缓冲液:乙腈等不同流动相中运行，寻找分离PCM和PAM的最佳条件。结果表明，在流速为1.0 ml/min、检测波长为270 nm的条件下，含磷酸盐缓冲液(pH-4):甲醇(65:35v/v)的流动相与其他流动相相比，具有清晰、清晰、峰尾最小的特点。在此条件下，PCM和PAM的保留时间分别为4.04 min和7.367 min。图4)和经优化的色谱条件(表1)．
图4:PCM (tR 4.04 min)和PAM (tR 7.367 min)标准溶液色谱图。
表1:优化了同时测定PCM和PAM的色谱条件
采用以下参数对优化后的RP-HPLC方法进行验证。
PCM和PAM分别在32.5 ~ 97.5μg/ml和2.5 ~ 7.5μg/ml标准溶液浓度范围内呈线性响应。
从检测限(LOD)和定量限(LOQ)两个方面评价了该方法对PAM和PCM的灵敏度测定。LOD和LOQ用以下公式计算。
Lod = 3.3 × σ/ s
Loq = 10 × σ/ s
在那里,
σ =响应的标准差
S =校准曲线的斜率。
通过重复性、日间和日内精密度验证了方法的精度。重复性研究通过分析3种不同浓度的药物在同一天6个重复。通过分析同一天不同时间间隔的样品溶液和不同日的日间精度来确定日内精度。
在预先分析的样品中，已知量的纯药物标准溶液(PCM和PAM)以三种不同水平加标。分别以80%、100%和120%水平进行试验。
鲁棒性是通过故意改变色谱条件来实现的。需要研究的重要参数是两峰间的分辨系数。通过逐个改变以下参数来检验鲁棒性:
流动相比变化±0.2 ml[磷酸盐缓冲液(pH 4):甲醇(67:33v/v)和磷酸盐缓冲液(pH 4):甲醇(63:37v/v)]
流量变化±0.2 ml/min (0.8 ml/min。1.2 ml/min)每次改变后，注入样品溶液，检查系统适宜性参数的%测定。
移动相pH变化±0.2 pH[磷酸盐缓冲液(pH 4.2):甲醇(65:35v/v)和磷酸盐缓冲液(pH 3.8):甲醇(65:35v/v)]。
为了检验系统的适用性，确定了理论板数、分辨率、保留时间和尾砂因子[17］．
称量20片，确定平均重量，最后制成粉状。然后将精确称量的相当于650 mg PCM和50 mg PAM的片剂粉末转移到含有5 ml甲醇的10 ml体积瓶中，超声20分钟。通过0.45μm过滤器过滤溶液，用甲醇调节体积至标记值。从上述溶液中取1ml放入10ml的量瓶中，用甲醇调节体积至标记值，得到PCM (65μg/ml)和PAM (5μg/ml)的最终浓度。取20 μl试液注射，记录色谱，计算药量[18］．
本研究以磷酸缓冲液(pH-4)和甲醇(65:35v/v)为RP-HPLC流动相同时估计PCM和PAM的方法开发和验证研究结果如下:
以磷酸盐缓冲液和甲醇为流动相，在C18柱上采用反相高效液相色谱法将PCM和PAM完全分离。当甲醇含量从80%开始降低，每降低5%，可以观察到峰展宽、峰前和峰尾。由于甲醇百分比的降低和使用磷酸盐缓冲液(pH-4)，观察到一个尖锐和分离良好的峰。随着甲醇浓度的逐渐降低，峰展宽，前缘和尾尾明显减小。最终以磷酸缓冲液(pH-4):甲醇(65:35 v/v)为流动相，在流速为1ml/min时获得合适的分离度。（图4） (表1）
分析过程的线性是指其(在给定范围内)获得与样品中被分析物的浓度(量)成正比的测试结果的能力。[6PCM在32.5 ~ 97.5μg/ml范围内，PAM在2.5 ~ 7.5μg/ml范围内呈线性(R2 = 0.9995, PAM为0.9995);结果显示在(表2)．
表2:采用该方法获得PCM和PAM的线性数据。
单个分析方法的检出限是指样品中可被检测但不一定定量为准确值的被分析物的最低量。个别分析程序的定量限度是指样品中可以适当的精度和准确度定量测定的分析物的最低量[6］．LOD和LOQ由各自的方程计算。PCM和PAM的LOD值分别为2.26和6.86μg/ml。PCM和PAM的LOQ值分别为0.16和0.55μg/ml。（表2）
分析程序的精度表示在规定的条件下，从同一均匀样品的多次采样中获得的一系列测量值之间的一致程度(散射度)。精密度可从三个层次考虑:可重复性、中等精密度和可重复性[6］．重复性、日间及日间精度实验结果分别示于(表3)及(表4)．所开发的方法是精确的，日内和日间精度研究的重复性RSD值< 2%。
表3:PCM和PAM的重复性研究。
表4:PCM和PAM的日间和日间研究。
分析方法的准确性表现为被公认为常规真值或公认参考值的值与实际值之间的一致程度。[6]如(表5)及(表6)，在不同添加浓度下，PCM和PAM的回收率在99 ~ 101%之间。
表5:PCM精度的测定。
表6:PAM的准确度测定
计算各参数峰面积的标准差，发现RSD小于2%。结果显示较低的% RSD值，见(表7)，表示该方法的鲁棒性。
表7:PCM和PAM的鲁棒性研究。
系统适宜性测试是许多分析程序的一个组成部分。测试所基于的概念是，待分析的设备、电子设备、分析操作和样品构成一个整体系统，可作为整体系统进行评估。[6]对标准溶液进行柱效率、分辨率和峰不对称性计算，计算结果见(表8) [17］．
表8:系统适宜性参数。
当分析剂型时，PCM和PAM在270 nm扫描时，分别在保留时间4.04 min和7.36 min时出现了清晰清晰的峰。已上市配方的检测结果见(表9) [18］．
表9:药物配方的定量测定。
开发并验证了RP-HPLC方法简便、准确、精密度大、经济。该方法可应用于对乙酰氨基酚和帕帕abraom原料药剂型的常规定量分析。
作者感谢Ami生命科学私人有限公司和Astron制药公司，古吉拉特邦，印度提供免费样品。我们希望对印度钦奈的Anthus制药公司表示感谢，为其提供市场配方。我们衷心感谢印度古吉拉特邦Sat Kaival药学院为我们提供的完善的后勤支持和指导。
