发展低温贮藏前后猪孤雌生殖的胚胎来自early-delipated卵母细胞

文摘

本研究调查的影响delipation(除脂滴)的发展能力猪卵母细胞。Delipated(+ /−)和/或玻化(+ /−)卵母细胞受到孤雌生殖的激活,孤雌生殖的早期胚胎的可行性被记录,然后胚胎转移到收件人进一步发展。结果表明,乳沟胚泡利率的孤雌生殖的胚胎早期delipated卵母细胞的胚胎均明显低于对照组(undelipated卵母细胞)(P < 0.05)。后转移到受体猪,这些胚胎能够进一步开发和生产孤雌生殖的胎儿。使用最小卷冷却(MVC)方法,孤雌生殖的胚胎早期delipated卵母细胞可能是低温贮藏玻璃化1-cell早期胚泡阶段。解冻后,早期胚泡阶段被发现为玻璃化是最优的。还在2 - 4细胞来源于早期胚胎玻化delipated猪卵母细胞被转移到两个收件人,并导致肢芽阶段胎儿。总之,结果表明,单性生殖的胎儿可以产生从猪胚胎玻璃化之前或之后的战略组合在vitro-matured (IVM)卵母细胞delipation与玻璃化在任何早期胚胎发育阶段。这种方法可能应用低温贮藏的克隆和胞浆内精子注射(ICSI)胚胎来自delipated卵母细胞。

关键字

猪卵母细胞,Delipation,低温贮藏,孤雌生殖。

介绍

的低温贮藏哺乳动物卵母细胞和胚胎的应用程序保存遗传多样性和在体外人类受精协议。到目前为止,低温贮藏技术已经用于各种物种,包括兔子(1,2)、牛(3,4)、马(5,6),猫(7,8],老鼠[9,10和雪貂11),等等。然而,由于猪卵母细胞的生物独特性,生存和胚泡形成后验证还低(12]。

未能玻璃化猪卵母细胞和胚胎成功,主要是由于细胞内脂质含量高的卵母细胞(13)和广泛的细胞体积(14,15]。通过移除胞质脂滴(delipation),猪卵母细胞和早期胚胎的敏感性低温度显著降低。长岛et al。16和李et al。17)表明,生活,从delipated获得健康的后代,在体外受精后,核移植胚胎冷冻保存。Delipated,在体外成熟(IVM)猪卵母细胞可能受到冻结/变暖然后发达后孤雌生殖胚泡阶段(18),在体外受精(19)或胎儿后孤雌生殖(20.]。

基于上述研究,猪delipated胚胎的冷冻保存将卵母细胞的比这更大的实用价值。然而,在猪体细胞核转移(SCNT)和胞浆内精子注射(ICSI),重构胚胎的破坏加剧了,因为两次处理(精密控制和delipation),这不仅直接影响胚胎发育的稳定和减少胚胎存活率,但也增加了操作上的困难。Delipation IVM的卵母细胞结合SCNT和ICSI可以减少劳动力,避免二次处理。此外,发展的特点孤雌生殖的胚胎类似的在体外受精胚胎(21),所以孤雌生殖的胚胎可以被认为是一个理想的模型系统分析冻存胚胎的发育能力来源于delipated猪IVM卵母细胞。

本研究调查的影响进行猪卵母细胞delipation发育能力后孤雌生殖和没有玻璃化。此外,我们决定vitrified-warmed的发展能力,早期孤雌生殖的胚胎在不同的发展阶段。

材料和方法

所有动物实验的动物保健委员会批准,云南农业大学。

化学物质

化学物质从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有指示。

卵母细胞的体外成熟

在获得许可在这项研究中,使用动物器官猪卵巢从Hongteng收集屠宰场(呈贡瑞食品有限公司有限公司,昆明,云南,中国)和运输到实验室的0.9% (w / v)氯化钠溶液在25 - 30°C。卵母细胞的获取和培养使用[描述相同的方法之前22]。总之,cumulus-oocyte复合物被从毛囊中获得3毫米直径6毫米,选择至少三层压实积云细胞。大约50卵母细胞培养在200毫升滴成熟媒介38.5°C在大气中5%的二氧化碳(APC-30D, ASTEC,日本)。

去除卵母细胞的胞质脂滴(Delipation)

去除卵母细胞的胞质脂滴如前所述执行(16]。裸露的卵母细胞是在猪受精卵孵化medium-3 (PZM-3)补充5.0μg /毫升CB(细胞松弛素B) 1.5或2.5 h,然后离心机在同一介质在1.5毫升微型离心机管在室温下13200 g×25分钟。合成的脂质层被卵母细胞(图1)通过精密控制使用斜抽吸管(外径、20 - 25μm)附加到显微操纵器在倒置显微镜(IX71、奥林巴斯、东京、日本)。卵母细胞脂质清除后,清洗和维护在PZM-3 38.5°C。

卵母细胞的孤雌激活和体外发展

10 - 20组早期delipated卵母细胞和undelipated卵母细胞(控制)洗两次激活解决方案组成的0.3甘露醇,0.5毫米玫瑰,0.01% BSA(脂肪酸免费),0.01毫米CaCl₂,0.01毫米MgCl₂。然后,卵母细胞被置于室连接到一个细胞电融合生成器(LF201 Nepa基因有限公司,日本)和两个平行电极与激活(1.0毫米)覆盖的解决方案。一个直流脉冲用于激活卵母细胞在输出电压150 V /毫米1×100μsec。激活后,卵母细胞在PZM-3孵化补充2.2μg /毫升CB 2 h,然后在25μl滴PZM-3培养基培养没有CB湿润的空气中含5%股份有限公司₂38.5°C。卵母细胞的正常发育不同阶段被记录在1、2、3、5和7天的文化,分别。囊胚细胞数的统计修正后,赫斯特33342染色在紫外线显微镜下观察。

脂滴染色

卵母细胞的胞质脂滴和孤雌生殖的胚胎是沾染了苏丹黑B,亲脂性的染料。短暂,卵母细胞或胚胎在10%甲醛溶液固定为3分钟,在蒸馏水洗,晒干,然后染色滴1%苏丹黑B在70% (w / v)乙醇4分钟,其次是在70%乙醇洗涤和干燥。材料被放置在1%伊红3分钟在蒸馏水洗,和干。准备的卵母细胞或胚胎终于安装在明胶在封面的过失和光学显微镜下检查在400 x放大。

胚胎的玻璃化

胚胎的冷冻保存是由玻璃化使用MVC方法如前所述[23]。玻璃化过程中使用的所有解决方案和变暖是准备使用一个基本的介质组成的中药- 199玫瑰(M5017)包含20毫米,4.2毫米NaHCO₃,75μg /毫升钾青霉素G和50μg /毫升硫酸链霉素。早期胚胎来自delipated卵母细胞被洗3次HEPES-buffered Tyrode的介质(子宫切除术)含有0.1% (w / v) polyvinylalcohol (PVA) (TLH-PVA),平衡在一个平衡的解决方案包含7.5% (v / v)乙二醇,7.5% (v / v) DMSO溶液和20%的边后卫4分钟接着接触玻璃化溶液中含有15%如蔗糖15% DMSO, 0.5米,20%的边后卫在30秒。胚胎被加载到一个MVC板,并立即投入液氮。这个过程是在1分钟内完成,1 ~ 3天后,沉浸的胚胎解冻MVC板直接解冻的解决方案包含1 M蔗糖和20%的边后卫为1分钟38.5°C。回收胚胎转移到稀释剂的解决方案包含0.5蔗糖和20%的边后卫3分钟然后被两个5分钟曝光清洗解决方案包含20%的边后卫去除冷冻保护剂。所有的解决方案都是保持在室温下,除了全球变暖的解决方案。

胚胎移植

杂交(巨大的白色/长白猪杜洛克猪)国债作为代孕母亲的2 - 4-cell-stage孤雌生殖的胚胎,如前所述[22]。在0和9 h第一站发情展出后,重构胚胎培养6 - 30 h激活后手术转移到输卵管的发情代孕母亲通过菌毛。手术后发现怀孕大约23天转移使用超声波扫描仪(hs - 101 v,本田电子有限公司有限公司Yamazuka,日本)。

实验设计

Experiment1。来自早期delipated卵母细胞孤雌胚胎的发展

卵母细胞挤压选择第一极体的清除胞质脂滴和使用5μg /毫升CB 1.5 h或2.5 h。每个治疗组包含25 - 30卵母细胞。早期delipated卵母细胞的孤雌激活后,胚胎的发育能力,包括他们的乳沟和囊胚率、检查和比较。调查孤雌生殖的胚胎体内发育能力,优秀的胚胎手术转移到输卵管的代孕母亲。怀孕的收件人被超声波扫描,检测和孤雌生殖的胎儿手术恢复一天26或27妊娠。

Experiment2。孤雌生殖的胚胎的发展来源于早期delipated vitrification-thawing后卵母细胞

孤雌生殖的胚胎从实验1解理和囊胚率高的直接使用MVC方法冻存1-cell, 2 - 4细胞,5 - 8,桑椹胚和囊胚早期阶段。形态(图2 e和f)并进一步解冻后胚胎的发育能力。2 - 4-cell-stage胚胎解冻后转移到接收方金边债券。怀孕在接受者被超声波扫描在一天大约23日和孤雌生殖的胎儿手术恢复。

统计分析

方差分析(方差分析,PROC GLM)都使用了SAS统计软件包(SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)。P < 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

来自早期delipated卵母细胞孤雌胚胎的发展

评估的影响胞质脂滴去除卵母细胞的发育能力,delipated卵母细胞进行孤雌生殖的激活,然后劈理和囊胚率记录。的胚胎来自卵母细胞和没有delipated卵裂阶段正常发育,但1.5和2.5的卵裂率h CB-treated组显著低于对照组(分别为54.2%,64.6%,82.8%,P < 0.05;表1,图2 a和c)。。在文化7 d在体外囊胚率分别为20.2%和32.6%,1.5 h和2.5 h与CB delipation后治疗,分别控制和41.6%,表明三组之间的显著差异(P < 0.05;表1,图2 b和d)。胚泡的细胞数量在三组之间没有显著性差异(P > 0.05)。

胚胎的差异源于卵母细胞和没有delipated是显而易见的显微照片与苏丹黑b染色后的脂质滴出现黑色或蓝黑色丸,允许有和桑椹胚的胚胎从undelipated卵母细胞染色深。delipation之后,大部分的黑色或蓝黑色丸(即。,the lipid droplets) were removed from the oocytes, and the 2-cell and morula embryos appeared pink (图3)。

调查孤雌生殖的胚胎体内发育能力,优秀的胚胎早期delipated卵母细胞是手术转移到输卵管的两个代孕妈妈怀孕被超声波扫描检测。23或41孤雌生殖的胎儿从两个代孕母亲中恢复过来了剖腹手术在妊娠26或27天,包括4或5生活,9到16人死亡,10或20胎儿吸收,分别为(表2)。的平均重量4生活和9死胎儿恢复一天26日分别为0.3967 g和0.1732 g,分别。平均重量在5生活和16天27具胎儿尸体分别为0.5163 g和0.3772 g,分别为(表3和图4 b)。

孤雌生殖的胚胎的发展来源于早期delipated卵母细胞玻璃化和解冻之后

在实验1的基础上,孤雌生殖的胚胎来自delipated卵母细胞冷冻保存在1-cell, 2 - 4细胞,5 - 8,桑椹胚和囊胚早期阶段使用MVC方法检查陶瓷的可行性,解冻的胚胎。结果表明,陶瓷,解冻胚胎发展解理和胚泡阶段(图2 e和f)。在上述人群中,囊胚率最高的胚胎玻化早期胚泡阶段。虽然没有统计上的显著差异组囊胚率(P > 0.05), 2 - 4-cell-stage胚胎往往表现出更高的囊胚率(19.3%)比的1-cell -和5 - 8-cell-stage胚胎(14.6%和14.7%,表4)。

评价体内发育能力的2 - 4-cell-stage胚胎解冻后,我们胚胎转移到两个代孕母亲。通过超声波扫描一个接受者被确认为怀孕。剖腹手术在妊娠胎儿检测19天29,其中10例死亡,9被吸收(表5和图4)。

讨论

猪胚胎在本质上对低温敏感,因为大量的出现在他们的卵母细胞胞浆内脂滴。因此,产生的胚胎在体外(24,体内25),通过克隆26)或卵母细胞受精(16)有一个低存活率或低温贮藏后的后续发展能力。有人建议,胚胎的cryotolerance delipation[等预处理后,会增加27),细胞骨架稳定(28]或膜成分变更(29日]。

本研究评估孤雌生殖的胚胎的发育能力来源于delipated猪IVM卵母细胞。因为相似的孤雌生殖的胚胎的发育特征在体外受精胚胎(21孤雌生殖,可以提供一个有价值的衡量卵母细胞的能力,被认为是一个理想的模型系统。我们的研究结果表明,陶瓷,孤雌生殖的胚胎来自delipated猪IVM卵母细胞发展到胎儿阶段。这个结果可以用于猪SCNT和ICSI。在SCNT和ICSI,透明带卵母细胞被摧毁的注入体细胞或精子进入卵母细胞。Delipation SCNT和ICSI胚胎的早期阶段期间增加了操作的难度和破坏胚胎。相比之下,delipation精子注入卵母细胞在体细胞或避免第二个处理的胚胎,这节省时间和减少胚胎的破坏。

在这项研究中,我们发现delipation之前,用CB治疗可以大大减少操作时间,提高早期delipated卵母细胞的存活率(数据没有显示)。CB微丝抑制剂,可以破坏肌动蛋白聚合和防止胞质分裂而不影响有丝分裂。所以治疗的细胞CB等离子体膜更少的刚性和更有弹性,这样微丝在精密控制中断(30.]。此外,我们的研究结果显示,2.5 h与CB治疗的发展能力高于1.5 h治疗组。很可能与CB处理2.5 h有积极影响,没有明显的毒性,相反,长期干扰造成的细胞质贩卖actin-tubulin解聚作用消极地影响发展当CB治疗3 - 5 h (31日]。

在我们的研究中,孤雌生殖的胚胎的发育能力来源于delipation卵母细胞没有改善与对照组相比。这个结果是类似于先前的研究18,19),这表明,体外受精和孤雌生殖的胚胎的囊胚形成率来自delipated IVM卵母细胞很低。卵母细胞的胞质脂滴可以专门提供能量,直到胎盘猪和发展中发挥作用的合成第二信使在胚胎发育阶段(32]。所以去除脂滴会有负面影响卵母细胞的发展。虽然脂滴的角色在细胞质中没有澄清在这项研究中,猪孤雌生殖的胚胎来自delipated IVM卵母细胞可成功发展到囊胚阶段在体外和肢芽阶段体内。因此,脂滴在猪卵母细胞的作用应该进一步调查。

此外,我们的研究结果表明,低温贮藏的最佳时间是胚泡阶段,早期囊胚率reexpansion解冻后,57.1%的速率高达玻化,孤雌生殖的胚胎(23,33]。玻化,delipated猪胚胎桑椹胚和囊胚阶段扩大能够实现postwarming存活率高,按照先前的报道(23,34,35,36]。这个结果可能发生,因为减少脂质含量,增加公差在晚期胚胎冷冻(37]。

关于阶段具体不同的公差冻结孤雌生殖的胚胎的发育能力陶瓷在不同的卵裂阶段在本研究进行了比较。尽管没有显著差异在统计,2 - 4细胞期胚胎囊胚率较高的显示趋势比1-cell和5 - 8阶段的胚胎。此外,怀孕率很低时,胚泡被转移到代理。所以我们选择vitrified-warmed 2 - 4细胞期胚胎转移到代孕母亲和肢芽能够开发阶段体内。注意,相比之下,delipation在最初的胚胎发育阶段,卵母细胞的早期delipation减少造成的伤害在透明带消除极化脂滴。猪孤雌生殖的胚胎的冷冻保存成功源自早期delipated卵母细胞不仅能促进长期保存有价值的基因,但同时也研究这些基因和单性生殖。

总之,目前的研究表明,猪孤雌生殖的胚胎早期delipated卵母细胞能够形成囊胚在体外和肢芽阶段体内。此外,delipated卵母细胞可以在任何玻化早期胚胎阶段,解冻后继续发展。这种方法有很大的潜力,因为它表明,猪SCNT和ICSI胚胎来自delipated卵母细胞可以直接冻存,这一发现可以促进SCNT和ICSI技术的应用。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(格兰特no.31360549),云南省项目中产和青年学术技术带头人(批准号和青年项目2013 hb011)云南省应用基础研究项目(批准号2012 fd022)。作者欣然承认明治大学教授Hiroshi长岛,日本与低温贮藏过程的技术援助。

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