研究和评论:药物分析杂雷竞技苹果下载志》上
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疫苗分析开发默克公司。西点军校,PA 19486
收到日期:18/01/2017;接受日期:26/01/2017;发表日期:03/02/2017
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一些疫苗过程制造技术需要使用醋酸(Ac)和磷酸盐(Pi)包含缓冲区来完成生化反应之前,下游产品净化。这两种阴离子必须从最后的散装产品,这需要需要一个分析监控Ac和π在减少。由于分离速度、低容量消耗,和分辨能力,毛细管电泳(CE)方法已被选为分离和量化这些阴离子在最终产品的水平和进程内中间样品。此外,这个优化CE法已经成功地资格,通常用于支持疫苗过程开发。
疫苗醋酸、毛细管区带电泳、磷酸盐、ProcessIntermediates。
复杂的出现在疫苗研制疫苗生产技术提出了新的和独特的分析挑战,需要严格的分析特征除了标准的释放和稳定分析1]。世界卫生组织(世卫组织)和药典机构提供指导和建议类型的版本,几乎所有的疫苗产品稳定性和性能测试(2,3]。其中,表征和间隙确认进程内的残差是很重要的安全有效疫苗的制造和释放药物产品。只有有限的出版物对残差分析疫苗产品生产过程(4,5]。下游净化复杂的疫苗是一个多阶段的过程,涉及疫苗生产的净化产品和制定最终alumbased佐剂。生产和净化过程中介绍了一些化学物质,其中一些需要在下一步之前删除。醋酸盐和磷酸盐阴离子是两个的化学添加剂在净化过程中需要监测和一些复杂的疫苗之前制定的最终产品。此外,这两种阴离子残差可以作为代理为其他小分子阴离子间隙。起始物料监控和进程内残留特性单独或结合使用基于高效液相色谱方法质谱分析(质)医药制造业是有据可查6,7]。我们所知,只有一个报告关于描述可用的剩余工资使用毛细管电泳(CE)的方法在疫苗研制8]。CE-based方法提供了一种快速分离时间,分辨能力高,样品消耗低,废物产生非常低。最常见的CE技术用于阴离子分离毛细管区带电泳(CZE)和间接分析物紫外检测方法(9- - - - - -11]。这里讨论的方法使用商用阴离子分离装备CElixir™OA从Microsolv技术公司CElixir™OA使用专利动态毛细管涂层系统达到一个高度可再生的阴离子分离在pH值为5.412- - - - - -14]。
在本文中,我们报告的使用这CElixir™技术分离和优化的定量方面残留醋酸和磷酸盐在多疫苗产品要求使用醋酸和磷酸盐促进生化反应在制造业。我们也研究如何使用该方法对醋酸进程内的监控和磷酸及其作为产品发布测试。此外,我们讨论不同的评价分析性能特征,如线性、准确性,以及定量的限制(定量限)和展示能力的方法进行验证。
试剂
的CElixir™OA, pH值5.4 CZE工具包获得从Microsolv技术公司(美国新泽西州Eatontown)。磷酸和乙酸标准从丙烯酰胺分析获得,Sigma-Aldrich品牌(圣路易斯,密苏里州,美国)。解决方案的溴化氢和氢氧化钠用于毛细管再生用材料Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。
样本类型
各种疫苗进行方法开发的中间体。样本使用各种纯化色谱法步骤由疫苗过程研究和开发小组默克研究实验室(默克公司& Co .公司,西点军校,PA,美国)。最后水产品(FAP)样本测试以及进程内的各种疫苗生产的中间体产品
CZE过程
所有运行进行了贝克曼库尔特PA800或P / ACE最小检测量毛细管电泳仪器(美国贝克曼库尔特,CA)。CZE分离进行了使用长度60.2厘米x 75μm IDx375μm OD bare-fused石英毛细管(美国贝克曼库尔特,CA)。探测器(Ld)的毛细管长度是50.2厘米。毛细管首先是涂有poly-cation(引发剂),随后与背景电解质含有紫外线吸收材料在254 nm(加速器),样品是注入水动力地在1 psi 15秒短水塞。7.0分钟30.0 kV的分离发生反极性应用于阳极和阴极,典型的观察到电流4 ua。二极管阵列检测器(爸爸)是用于检测峰值使用8毫米孔径。毛细管壁被清洗再生每次分离后,0.1 m氢氧化钠溶液,H2啊,0.1解决哈佛商业评论,H2O 3分钟每循环在仪器运行序列。
标准和样品制备
商用醋酸盐和磷酸盐标准稀释的0.063毫米到1毫米CE年级水。疫苗样本稀释到适当的稀释基于各自的中间步骤或FAP被测试。样本然后过滤去除样品制备的疫苗产品矩阵。滤液被转移到PCR瓶和注射在贝克曼库尔特PA800复制系统。
CZE分离
pH > 3、硅醇组在光秃秃的熔融石英毛细管电离离开毛细管内表面的负电荷。的CElixir™OA, pH值5.4工具包包含一个传播的引发剂溶液的带负电荷的石英毛细管聚阳离子形成双电层。加速器的解决方案包含一个带负电pyridine-dicarboxylic酸在pH值5.4和注入后,启动程序创建一个可再生的和健壮的electro-osmotic流(EOF)对反极性或阳极分离条件下的阳极。注射后,带负电荷的分析物,如醋酸和磷酸盐,将通过两个单独的静电和EOF部队向阳极创造快速分离。标准和样品分析与间接紫外检测在254海里。负的电荷pyridine-dicarboxylic酸加速器解决方案作为一个发色团,完全吸收紫外线能量254海里产生一个完整的探测器响应。当负离子如磷酸、醋酸通过检测窗口和取代消极的发色团,探测器将减少吸收和记录负峰,然而计算机仪器反转信号自动显示积极的峰值输出。图1举例说明了一个electropherogram Ac和π离子分离与迁移1毫米每4.8分钟,5.2分,分别。pH值5.4磷酸和醋酸熊一个负电荷,然而乙酸质量少,因此在毛细管自CZE更快的流动分离是基于荷质比(图1)。
图1所示。标准的electropherogram醋酸(Ac)和磷酸盐(π)离子注入在1毫米。它们的迁移时间大约4.8和5.2分钟,分别。
关键试验参数的优化
Autosampler和毛细管温度:我们观察到在实验室auto-sampler储存在室温下样品,样品25°C,会导致脱水速度约为每小时4μL。这种趋势会导致不可预知的分析物浓度的增加导致高估和不可靠的醋酸盐和磷酸盐决定。没有样品脱水时观察auto-sampler温度维持在12°C。预计乙酸酯和磷酸迁移时间取决于温度自electro-osmotic逆粘度依赖注入analytes15速度足够的分离和分析物的迁移是观察到20°C,因此,毛细管温度没有变化在发展。然而,毛细管温度变化作为我们的鲁棒性研究计划的一部分在化验资格。
样品过滤和稀释
为了分析残留醋酸和磷酸盐在疫苗产品(MW > 100 kDa), 100 uL样品转移到30 kDa或10 kDa MWCO过滤和离心去除疫苗产品。滤液收集和75 uL是CE分析转移到PCR瓶。在一般情况下,过滤器包含一些化学物质用作防腐剂,可能会干扰醋酸或磷酸山峰,因此重要的是屏幕上各种不同生产过滤器。(图2一个来自不同供应商的)说明了各种过滤器测试通过添加100 uL水和离心机。四个不同的过滤器,笼罩在3 k, YM30笼罩10 k,微孔30 k所示(图2一个),跟踪2、3、4和5,分别。这表明每个过滤器都有略微不同的检测残差或没有可检测残差,如在微孔30 k (图2一个跟踪5),控制样品(图2一个,跟踪1)不是通过过滤器显示了一个干净的痕迹;此外微孔30 k滤波器与控制因此选择这个过滤器,用于后续研究。使用微孔的醋酸盐和磷酸盐electropherogram 30 k滤波器跟踪6所示(图2一个)说明笼罩3 k(跟踪2)和PALL10K(跟踪4)残余峰,与醋酸co-migrates 4.8分钟,YM30(跟踪3)与磷酸在5.3有一个潜在的干扰峰。因此,它是至关重要的评估和找到一个过滤器non-detectable残余峰值。同时,强烈建议过滤器在使用前用水洗了两次,因为不同的大量的过滤器从相同的供应商可能无意中包含不必要的化学品(数据未显示)图2一个。
图2 a。重复的水注入从各种过滤器筛选;空白水没有过滤器控制(跟踪1),笼罩在3 k(跟踪2),YM30(跟踪3),10 k(跟踪4)棺罩,微孔30 k(跟踪5)。跟踪6是醋酸盐和磷酸盐标准,使用微孔过滤30 k。
监管规定要求的残留金属和化学添加剂,如乙酸、磷酸,造成生物制造过程(16]。使用多个diafiltration步骤在这个复杂的疫苗产品的净化。最初的净化流程使用醋酸缓冲与浓度范围从10毫米到100毫米取决于疫苗类型,而后续下游纯化步骤与磷酸盐缓冲10毫米到400毫米的浓度范围是补充道。这导致同时引入磷酸和删除醋酸的过程。以来的相对浓度醋酸和磷酸盐在每个过滤步骤可能不同,不同稀释方案开发定量的分析物在下游净化。图2 b演示了疫苗的分离观察当D2样中间注入不稀释定量的乙酸图2 b。
图2 b。Electropherogram D2步骤样品注射醋酸整齐显示峰值约为4.8分钟和大型磷酸峰值约为5.2明尼苏达州。
D2样是第一净化添加删除步骤中醋酸和磷酸盐的后续下游净化过程。因此D2样品中的磷酸盐峰值大,为了测量磷酸盐在这个示例类型,它必须被稀释1所示图2 c。
图2 c。Electropherogram相同的D2一步40 x稀释样品分析磷酸。
最后,疫苗FAP产品注射醋酸的确认和磷酸盐浓度低于定量的限制(<)的分析(定量限图2 d)。大约3.5分钟的大峰是氯离子自最后一个缓冲FAP样本含有氯化钠图2 d。
图2 d。Electropherogram最终水的产品(FAP)示例说明缺乏醋酸盐和磷酸盐的峰值。氯化大峰观察从2.5分钟3.5分钟是归因于FAP样本中氯化钠的存在。
磷尾矿峰值
在每次运行的毛细管被洗涤条件0.1 m氢氧化钠和H2O为0.5分钟,也与哈佛商业评论0.1和H2O周期1分钟。假设,醋酸和磷酸盐离子能逐步结合的poly-cation引发剂层,导致峰展宽或尾矿。因此,哈佛商业评论酸洗液已实现删除聚阳离子聚合物除了基本氢氧化钠洗。然而,峰值跟踪还是60注射和恶化90注射后观察到如图所示的红色痕迹(图3一对磷酸盐)。
图3。磷酸峰值显示在注射1(黑色跟踪)和峰值尾矿注入90(红色痕迹)。
峰值尾矿不观察醋酸阴离子(数据没有显示)。这是怀疑,这一现象可能是因为不够整理后的毛细管分离和洗涤时间增加四个解决方案3分钟。图3 b显示了一个覆盖的磷酸和乙酸标准注1(黑色跟踪)和200年(红色痕迹),峰的形状是一致的,没有延长后观察到尾矿洗到3分钟。
图3 b。醋酸盐和磷酸盐的山峰在标准样品在注射1所示(黑色跟踪)和注入200(红色痕迹)没有任何尾矿峰值增加氢氧化钠和哈佛商业评论洗到3分钟后的分离。迁移时移可能是因为缓冲损耗。
评估性能特征
国际协调会议上表明,资格和验证是高度推荐的分析方法定量检测杂质的控制和/或限制测试杂质(17]。所有标准资格评估包括精度、内部和inter-assay精度,重复性,坚固,特异性,检测极限(LOD),定量限度(定量限)和线性。
峰迁移时间一致性
峰迁移时间内测定精度最初评估200年评估标准的注射。intraassay迁移时间%醋酸盐和磷酸盐RSD为1.2%和1.4%,分别与每10减少缓冲缓冲增量损耗。inter-assay迁移时间精度的实验在多天的120注射总收益率% RSD为6%的醋酸和磷酸盐。能够很好的证明,迁移时间一般为基于毛细管的方法重现性不如保留时间再现性为基础的高效液相色谱方法。有许多已知的因素可能导致迁移时间变化基于毛细管的方法,特别是影响因素EOF (18]。这些因素影响EOF、最小化分析物与毛细管壁相互作用和维护一个高电荷密度沿毛细管壁内部整个分离是至关重要的维持一致的国际米兰,盘中高点迁移时间(18,19]。在这项研究中,当迁移时间发生改变,醋酸和磷迁移时间转移同时在给定注入领先我们相信小变化观察是由于大部分运动变化的而不是毛细管壁相互作用。因此,我们将这一现象归因于稍微变量EOF从注射注射可能引起的矛盾在我们电子的电荷密度双层内部毛细管壁多个注射。这些迁移时间不一致不会干扰我们的量化能力醋酸和磷酸盐,不阻止的方法用于产品发布的能力。
峰身份的确认
阴离子的峰值的身份被确认通过观察样品的迁移上升0.25毫米的商用醋酸和磷酸盐标准D2样例包含两个分析物。因为磷酸存在在更高浓度磷酸40倍稀释后,添加额外的。每个飙升样本与样本覆盖运行整洁确认身份(峰值图4一)。
图4。峰身份确认和回收率试验(A) 0.25毫米醋酸标准上升为D2步骤示例显示峰值为4.8分钟增加。
图4 b显示信号强度的增加乙酸酯和磷酸当这些各自的分析物被上升到疫苗样本。
图4 b。0.25毫米磷酸盐标准上升到40倍稀释样本显示峰值为5.2分钟增加D2一步。
此外,分析物都上升到FAP示例所示(图4 c)。图4 c
图4 c。:0.25毫米醋酸盐和磷酸盐标准上升到FAP样本。
定量参数
标准曲线线性评估在选定的浓度范围(0.063毫米到1毫米)3个人实验发生在不同的日子里对磷酸和乙酸(图5一个)。
图5:醋酸的标准曲线(●黑色)和磷酸盐(▲红色)。
标准曲线上生成的三天。决定系数(R2)为每个生成的标准曲线测定。所有曲线显示确定系数> 0.998。此外,inter-day %为三个独立的浓度测量在一个给定的标准曲线值< 10%为阴离子。
估计方法的精度提出了新的CZE方法得到醋酸盐和磷酸盐通过执行内部和inter-day测定精度的测量(n = 3)过程中间样品在D2的一步。醋酸的相对标准偏差(RSD)小于5%,磷酸的增加% < 10%醋酸为磷酸盐相比,很可能造成额外的稀释需要测量磷酸盐在这个特定的示例。intra-assay峰面积精度为200注射RSD < 5%醋酸和磷酸盐在两个浓度水平0.25毫米和1毫米(所示图5 b)。
图5 b。注射之间交替注入0.25毫米(100)和1毫米醋酸(100注射)和磷酸盐标准来评估200年总峰面积精度注射。峰面积%相对标准偏差< 5%,0.25毫米和< 3%在1毫米醋酸和磷酸盐浓度。
该方法的准确性取决于飙升醋酸和磷酸盐FAP样品(见参考标准为疫苗图4 c)。两个已知的醋酸盐和磷酸盐标准浓度在低端(0.063毫米)和中东(0.25毫米)。%醋酸复苏范围从85%到107%,而对于磷酸%回收率从101%到104%不等。
检测极限(LOD)乙酸酯和磷酸,用这种新方法大约是0.031毫米的信号噪声比3,和量化的限制(定量限)约为0.063毫米的信号噪声比10。
醋酸盐和磷酸盐测定过程中样本
使用上面描述的方法,分析了残留醋酸盐和磷酸盐在多个过程中间样品。乙酸酯和磷酸作为缓冲区添加在适当的疫苗生产过程。他们的许可是通过几个diafiltration步骤执行。图6显示了一个典型的醋酸和磷酸盐分析样本矩阵获得各种生产过程的步骤。磷酸添加醋酸的初始步骤没有进入样本矩阵称为D1。
图6:醋酸的条形图表示(黑条)和磷酸盐(红色栏)疫苗过程中间隙。初始样本(D1)步没有测试,没有磷酸,包含10毫米到100毫米之间的名义醋酸浓度取决于疫苗类型。一般来说,醋酸后清除D3 D10后步骤和磷酸盐。没有检测到醋酸盐和磷酸盐在所有FAP样本。
醋酸然后删除通过几个后续diafiltration步骤而磷酸盐添加在D2 D3一步一步,达到顶峰。通过D10磷酸盐去除始于D4。表1显示了典型的醋酸盐和磷酸盐的结果为一组过程中间样品(表1)。
| 一步 | (醋酸)毫米 | (磷酸盐)毫米 |
|---|---|---|
| D1 | 50 | 0 |
| D2 | 0.19 | 4.5 |
| D3 | < 0.063 | 383年 |
| D4 | < 0.063 | 137年 |
| D5 | < 0.063 | 58 |
| D6 | < 0.063 | 27 |
| D7 | < 0.063 | 12 |
| D8 | < 0.063 | 5.4 |
| D9 | < 0.063 | 0.97 |
| D10 | < 0.063 | < 0.063 |
| FAP | < 0.063 | < 0.063 |
表1:典型的醋酸盐和磷酸盐间隙。
醋酸虽然不知道是有害的,其残留去除是用作其他代理分析小分子物质添加pre-D1一步的许可。最后的散装产品磷酸间隙是至关重要的,因为添加明矾佐剂,众所周知,磷酸反应与明矾。此外,磷酸残也被用作代理分析过程中加入的其他小分子和金属(D3步骤)。
剩余乙酸和磷酸盐阴离子测定了评估疫苗过程中间体和最终产品通过CE的方法。虽然有离子色谱法(IC)测定乙酸酯和磷酸(20.,21]。常规的方法是相对漫长而繁琐的测试。除了这个IC分析使用高pH洗脱液需要严格控制由于测量电流的检测,轻微的pH值的变化已经知道引入额外的分析变异的来源。CZE技术已被证明是一个可靠的工具,量化中,证明清除残留醋酸和磷酸盐在多进程内和FAP样本疫苗产品。展示的残余缓冲组件最终产品发布测试所有候选疫苗的成功至关重要的添加剂缓冲区用于生产,但不需要在最后的产品。此外,由于醋酸盐和磷酸盐阴离子相似的其他有害小离子过程剩余工资,这个分析也可以作为代理确认没有这些残差最终水性产品。我们还证明,这种分析是适合预期用途GMP监管环境中使一个强大的替代方法一个昂贵的质谱或高溶剂残留分析消费高效液相色谱方法。足够敏感的方法用于剩余测试,可接受水平的准确度和精密度,健壮。这些方法属性测试进程内和FAP样品时提供可靠的结果。
我们要感谢剑他博士,博士和约翰·麦克尼尔。我们也想扩大我们的感谢我们的同事在默克公司疫苗生物工艺开发推广材料为我们提供所有的疫苗
