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P - ISSN: 2347 - 2286
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奥尔加佩特洛娃1*弗拉基米尔•古尔1,2,Iuliia Sergeeva1,2,谢尔盖Tatarkin1,尤里Gogolev1,2
1喀山研究所的生物化学和生物物理学、喀山科学中心,俄罗斯科学院喀山,420111年,俄罗斯
收到日期:07/08/2017;接受日期:28/08/2017;发表日期:05/09/2017
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在不利条件下细菌应激反应是长期以来被认为是与人口密度的降低,因为很大一部分细胞的死亡。然而,最近的例子在我们的研究碳饥饿的植物致病性Pectobacterium atrosepticum SCRI1043已经证明的情况下细菌人口密度很低(低于法定人数)适应策略可能与细胞增殖和细胞数量的增加。这种策略使低人口数量的细胞形成功能和实现细胞间的沟通必要的抵抗压力因素。在我们目前的研究表明,优化的人口密度和应力条件下细胞增殖不仅发生在碳饥饿,还在缺氮的过程中。根据初始人口密度、氮应激反应实现根据选择场景(相关细胞滴定度的增加或减少),自己之间的共同和独特的特征和类似碳饥饿引起的反应。
在不利条件下细菌应激反应是长期以来被认为是与人口密度的降低,因为很大一部分细胞的死亡。然而,最近在我们研究植物致病的碳饥饿的例子Pectobacterium atrosepticumSCRI1043已经证明的情况下细菌人口密度很低(低于法定人数)适应策略可能与细胞增殖和细胞数量的增加。这种策略使低人口数量的细胞形成功能和实现细胞间的沟通必要的抵抗压力因素。在我们目前的研究表明,优化的人口密度和应力条件下细胞增殖不仅发生在碳饥饿,还在缺氮的过程中。根据初始人口密度、氮应激反应实现根据选择场景(相关细胞滴定度的增加或减少),自己之间的共同和独特的特征和类似碳饥饿引起的反应。
适应;阻力;细胞增殖;固氮作用
细菌有很高的适应性可能提供各种不利条件下生存。一般有两种类型的适应策略由细菌选择取决于人口的密度。第一conversional策略逮捕相关细胞增殖,细胞溶解的部分自适应形式的人口和各种类型的形成是意识到人口密度时初应力效应是高1,2]。第二个发生如果人口密度很低(低于法定人数水平)。因此,人口规模的增加发生直到~每毫升106个细胞的阈值,当群体感应和严格的反应被激活。后者的例子所展示的策略是碳饥饿的Pectobacterium atrosepticum(Pba植物病原细菌()——gramnegative3,4),大肠杆菌(5)和许多其他种类的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌(未发表的数据),因此可能被认为是普遍的在不同的细菌。
在目前的研究中,我们审查如果压力条件下细胞分裂的现象是一个特定的反应意识到在缺乏外源碳或策略,能够抵抗其他营养素的缺乏(氮)。我们也比较Pba适应策略引起的氮和碳饥饿的教训的形成和应激相关基因的表达。此外,相关基因的转录水平氮同化的饥饿的文化比较高、低初始人口密度。
菌株、媒体和文化条件
的应变Pectobacterium atrosepticumSCRI1043(以前胡萝卜ssp。atrosepticaSCRI1043) (Pba)[6)是生长在磅(Luria-Bertani)介质或D5中(100毫米磷酸钠缓冲区,pH值7.5,1 g L1NH4Cl, 0.3 g L1MgSO4×7 h2O和2 g L1蔗糖)和曝气(200 r.p.m。) 28°C。获得氮饥饿的文化,Pba细胞生长在LB培养基收获(8000 g, 10°C, 10分钟)在早期平稳增长阶段,然后洗两次NH4Cldepleted D5介质,resuspended NH4Cl-depleted D5中初始种群的密度为102-10年9CFU /毫升,在不曝气的玻璃瓶中孵化28°C。菌落的滴定度(cfu)是由电镀系列10倍稀释的细胞悬浮液在0.5%氯化钠到1.5%磅后琼脂0,4、8、12、18、24、48和72小时的潜伏期。媒体用于这项研究在121°C热压处理过的40分钟. .
蔗糖吸收试验
跟踪外源碳底物(蔗糖)的消费增长和nitrogen-starvingPba文化中,收集浮在表面的游离。获得浮在表面的,大量的细胞被撤了文化通过离心(14000 g, 10°C, 10分钟);剩余的细胞被过滤通过硝基过滤器(0.2μm;微孔、德国)。浮在表面的游离碳水化合物含量是衡量使用phenol-sulphuric酸测定[7]。
跟踪分析
评估cross-protective氮饥饿应激(主应力)的影响,饥饿的公差(或nonstarving)Pba对热休克细胞,过氧化氢和氯化钠(二次应力)检查。二次压力之前,不同的细胞密度Pba文化适应~ 106CFU毫升1通过稀释的物品中。二次压力挑战,1毫升整除的细胞悬浮液受到50°C 5分钟,或补充20%氯化钠或2.5毫米H2O2。前后5分钟、4、8和24小时接触的次应力因素之一(热休克或h2O2或生理盐水),磅琼脂悬浮液被镀到1.5%,连续10倍稀释。盘子在28°C两天,孵化cfu计数。细菌密度被表示为一个日志CFU /毫升。
毒力测定
早期固定相的毒性和氮饥饿Pba细胞是由能力决定引起的症状疾病土豆植物(茄属植物tuberosum简历。拿破仑情史)。超低温保存植物和种植axenically在试管中包含女士中有0.3%琼脂(8)与一个16 h光/ 8 h黑暗周期光周期为15 - 20天。此后,植物被接种Pba文化饥饿的细胞在四天在人口密度高或低初始或早期的固定相Pba细胞。培养液的效价调整为107CFU毫升1为所有的测试文化集中使用离心或稀释的物品中。10毫升的所得悬浮液(105 CFU /剂)被放置在轻微受伤使用无菌注射器杆。的百分比植物,这显示明显疾病症状或死亡,决心post-inoculation 7天。提出了数据在两个独立的实验中获得的值在20生物复制。
基因表达分析
细菌RNA提取后0、4、8、24和48小时孵化的Pba细胞的物品情况下使用RNAExtract试剂(Eurogen、俄罗斯)根据制造商的指示。总RNA治疗涡轮- DNAse量化使用一个量子位荧光计(美国表达载体)和用于互补脱氧核糖核酸的合成。逆转录的反应混合物含有100 pmol随机五个一,1毫米核苷酸,200 U RevertAid逆转录酶(美国热科学)与相应的1×反应缓冲区。首先,水和随机五个一涨跌互现RNA和孵化在70°C和冷却5分钟立即在冰上。其他组件被添加。使用DNA引擎执行孵化thermocycler (Bio-Rad、大力神、钙、美国)。执行反转录如下:10分钟25°C,其次是1 h 42°C和10分钟在70°C。两个μl cDNA用作qPCR模板。
实时rt - pcr进行使用伊娃格林反应混合物(合成醇、俄罗斯)。引物(补充表1)根据基因组序列的设计p . atrosepticumSCRI1043 (NCBI Gen -银行加入NC_004547)使用Vector-NTI版本9软件(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和合成,合成醇(莫斯科,俄罗斯)。PCR在下列条件下进行:2分钟95°C,紧随其后的是45周期在94°C 10年代,60°C 15和72°C 30年代。之后,融化曲线分析的温度范围60 - 95°C。反应是运行和荧光发射的变化被发现使用CFX96定量PCR系统(美国Bio-Rad)。的荧光PCR周期的绘制是一个函数使用大型管理软件CFX(美国Bio-Rad)。所有引物的扩增效率(E)确定使用一系列稀释的互补。额外的控制包括逆转录酶的遗漏测量残余基因组DNA污染的程度和遗漏的模板。目标基因的表达水平是计算相对于参考基因。geNorm软件被用来选择基因显示表达式在实验条件下的稳定。在六(gyrB, gro tufAB、ffh rpoD和recA)候选人参考基因tufAB, recA和ffh最稳定的表达水平;因此这些基因被用作参考的。三个复制每个反应的进行。相对表达水平确定相应的数量之间的比率cDNA目标基因和归一化因子的值,计算了使用geNorm软件。分析获得的数据展示的三个独立的实验。
统计分析
实验进行了三个生物复制,每一个化验技术一式三份。每个测试结果的差异的重要性和相对控制的价值观决定使用学生的学习任务。
CFU滴定度和有机碳消耗的动力学在缺氮
在nitrogen-starvingPba文化的高初始细胞密度,cultureable细胞的数量逐渐减少(图1)。因此,细胞外碳水化合物的含量减少,只在第一个小时的饥饿和进一步保持在大约40%的初始数量的水平表明蔗糖的消费只发生瞬变期间饥饿(图2)。反过来,当Pba细胞转移到nitrogen-deficient中等和较低的人口密度,细胞的数量增加,直到达到一个值约为106细胞每毫升(图1)。细胞外的内容的变更碳水化合物在这种情况下(没有被观察到图2)。
图1:CFU滴定度的动态nitrogen-starving p atrosepticum文化不同的初始人口密度:1.6×108CFU毫升1(白色三角形),2.0×107CFU毫升1(黑色三角形),2.5×106CFU毫升1(白色圆圈),2.0×104CFU毫升1(黑色圆圈),2.4×103CFU毫升1(白色钻石),3.8×104CFU毫升1(黑钻石)。提出数据平均值±SD三个独立的实验。
图2:外源性生长基质的内容(碳水化合物、蔗糖)的上层清液p atrosepticum文化孵化在缺乏外源氮(non-hashed列)和生长在最小D5中(散列的列)。媒体被接种高(1.1×108±9.8×106CFU毫升1、白列)或低(1.4×104±1.1×103CFU毫升1人口密度,灰色的列)。提出数据平均值±SD三个独立的实验。
nitrogen-deficient介质时补充NH的1 g / L4Cl,Pba人口密度增长进行,直到达到1 - 2×10的值9CFU毫升1而不管初始细胞密度高(1.1×108±9.8×106CFU毫升1)或低(1.4×104±1.1×103CFU)。因此,在成长的过程中,细胞外有机碳大大减少,只有微量的细胞外培养三天后发现了碳水化合物(图2)指向一个完整的外源性底物的利用率。
Nitrogen-starving阻力和毒性Pba细胞
确定如果氮饥饿诱导跟踪次应力因素的形成,生长和饥饿Pba细胞受到过氧化氢,渗透和热冲击。早期的固定相悬浮液的细胞,添加H2O2(2.5毫米)导致连续降低CFU滴定度孵化24小时后检测不到的水平(图3一)。尽管H2O2治疗的氮饥饿细胞也加上减少细胞滴定度曝光之后,菌落的数量逐渐恢复整个孵化(图3一)。抗H2O2收购饥饿文化的细胞接种在高和低的初始人口密度。
图3:早期固定相的阻力和为期4天nitrogen-starving p atrosepticum SCRI1043细胞:(A)过氧化氢的2.5毫米;(B) 20%生理盐水;(C)热休克(50°C)。灰色columns-early固定相的细胞,白人和黑人columns-starving细胞孵化在高和低初始人口密度,分别在nitrogen-deficient介质四天。开始之前的实验中,CFU饥饿和固定相早期细胞培养的滴定度调整到~ 106 CFU毫升1在无氮培养基稀释。价值观代表意味着±SD三个独立的实验。
热休克后5分钟50°C, CFU早期固定相的浓度测定细胞悬浊液成为零在暴露后的最初几个小时;8 - 24小时后休克CFU浓度构成最初的滴定度只有0.02和0.1%,分别为(图3 b)。氮饥饿细胞悬浮液,热休克后,CFU滴定度没有下降无法检测到的水平和恢复速度远远超过在悬浮液的细胞(图3 b)。孵化的增长在存在20%氯化钠与逐步降低CFU效价的0.2%的初始。反过来,虽然生理盐水治疗氮饥饿Pba细胞减少导致CFU效价曝光之后,细胞数量逐渐恢复整个孵化几乎初始水平(图3 c)。增加热休克和氯化钠的阻力是氮饥饿的特征Pba细胞而不管饥饿的文化高的初始细胞密度(1.1×108±9.8×106CFU毫升1)或低(1.4×104±1.1×103CFU)。
检查如果nitrogen-starvingPba保留毒性,土豆植物由日志增长阶段细胞被感染以及四天氮饥饿细胞低或高的文化最初的人口密度。植物感染的百分之六十二增长Pba细胞死亡或严重的显示疾病接种后7天症状。因此,100%和88%的植物被氮饥饿明显受损Pba细胞培养在低和高的初始细胞密度。这表明氮饥饿Pba细胞不仅保留其毒性,而且变得更加咄咄逼人。
应激反应和氮Assimilation-related基因的表达在缺氮
的表达水平relA(ppGpp编码合酶),现货(编码双官能synthate / ppGpp水解酶),和rpo(编码替代应激sigma-factor)基因检查过程中氮饥饿。的感应,这些基因的表达被广泛证明是与压力反应下碳缺陷和其他压力的影响9,10]。然而,在氮饥饿的Pba细胞,诱导的表达relA也不现货也不rpo观察(数据没有显示)。
的表达水平nifD和nifK基因编码α-和β-subunits固氮酶的nifH还原酶基因编码,传输电子从一个合适的捐赠者,如减少铁氧还蛋白(flavodoxin)、固氮酶的催化中心在氮同化过程中诱导氮饥饿在高和低细胞密度饥饿文化(图4)。氮的同化是通过全球控制转录监管机构NtrC (GlnG)或监管的蛋白质NifA或两个11,12]。的表达水平glnG基因Pba期间减少氮饥饿无论是否接种滴定度是高或低(图4)。反过来,转录水平的增加nifA文化基因在饥饿人口密度高;因此,在那些低细胞密度,这种基因的表达水平降低(图4)。
图4:基因的表达水平的动态,产品参与氮同化,nitrogen-starving文化p . atrosepticum。细胞受到氮饥饿在低(黑列)或高人口密度(白列)。代表的值意味着±SD三生物复制每个分析技术一式三份。
吸收氮的细菌可以被纳入氨基酸通过谷氨酰胺合成酶的作用GlnA和谷氨酸脱氢酶GdhA或嘧啶[氨基甲酰磷酸合酶,所编码的两个单元卡拉和碳水化合物基因。的表达水平glnA和gdhA基因减少氮饥饿Pba文化(图4)。因此,转录水平的卡拉和碳水化合物增加氮饥饿的文化过程中接种在高和低的滴定度(图4)。这表明[氨基甲酰磷酸synthase-dependent通路并入核苷酸诱导在铵氮饥饿Pba人群。
在目前的研究中我们已经表明,细菌在压力条件下人口密度的增加不仅仅是一个特定的反应碳饥饿;这种策略也意识到当衬底氮细菌耗尽微环境。当细菌受到氮饥饿人口密度高,他们意识到conversional战略压力反应与细胞滴定度的减少可能与人口的一部分的溶解或形成休眠细胞或两者兼而有之。因此,很大一部分外源性碳基质(蔗糖)仍在栽培介质,而不是被氮饥饿的细菌。反过来,如果人口密度很低在缺氮,增加细胞的滴定度发生了一定程度的每毫升106 CFU一样在碳缺陷被报道在我们先前的研究[3,4]。
碳缺陷已知细菌耐药性增加各种二次压力因素提供所谓的交叉保护的形成13]。交叉保护的影响Pba细胞的过程中实现碳饥饿而不管细胞受到应力作用下高或低人口密度(4,14]。然而,在氮缺乏条件下,形成的交叉保护细菌没有以前了。在我们的实验表明,另一种反应(与减少或增加人口密度)诱导缺氮的确增加细胞抵抗各种压力因素赋予交叉保护。此外,在氮饥饿,Pba保持细胞毒性,甚至比积极增殖细胞变得更加咄咄逼人。
交叉保护碳缺陷的形成是与特定基因编码蛋白的表达增加必要的压力反应的实现——合成酶RelA和合酶/水解酶的鸟苷tetraphosphate (ppGpp)和替代应力诱导sigma-38因子rpo (13,15]。在Pba,交叉保护碳缺陷的形成也与这些基因转录水平的增加(4]。然而,在缺氮relA的表达水平,发现和rpo基因并不增加虽然细胞获得交叉保护的表型。尽管ppGpp和rpo在很多情况下被证明是所需的压力反应和交叉保护的形成,有几个存在的证据ppGpp——RpoS-independent细菌适应机制(10,16- - - - - -20.]。到目前为止,ppGpp和RpoS-independent细菌适应机制仍然是谜。因此,我们的数据表明,交叉保护碳的形成(4和氮(本研究)挨饿Pba细胞可能通过不同的监管途径实现。
细菌应激反应的差别之一下碳和氮不足在于所谓的氮气压力反应的激活——用一种自适应的机制细菌清除替代氮源(12]。氮应激反应是加上由固氮酶大气氮同化。除了diazotrophic微生物,固氮酶复杂的存在在很多的代表肠杆菌科家庭:肺炎克雷伯菌、肠杆菌属aerogenes,肠杆菌泄殖腔,欧文氏菌herbicola,枸橼酸杆菌属中间部(21- - - - - -23]。在Pba大多数diazotrophic, molybdenum-iron固氮酶典型微生物是显示24]。
在我们的实验中,基因编码的两个单元Pba固氮酶以及NifH还原酶上调下氮饥饿无论是否接种滴定度是高或低。这些基因的表达是由全球转录监管机构NtrC (GlnG),导致主调节器的研究所固氮NifA激活氮同化(25]。研究所诱导nifA基因也发生独立的NtrC (GlnG) [11,26,27]。在我们的实验中,没有激活glnG表达发生在两种分析类型的氮饥饿Pba文化。然而,在高细胞密度文化中,nifA基因是高度诱导过程中氮饥饿。因此,没有增加这个基因的转录水平观察了饥饿的文化接种细胞密度较低。这些结果指出NtrC-independent活化氮应激反应Pba在上述条件下。在高细胞密度文化这种反应可能通过介导的NifA;监管机构从事协调氮应激反应在低人口密度仍然未知。因此,这取决于类型的氮应激反应(与增加或减少细胞的滴定度取决于初始人口密度)Pba有可能利用替代监管机制以适应压力环境。
由细菌同化氮列入生物质在氨基酸或核苷酸(28]。基因编码的酶的公司负责氮素转化为氨基酸没有诱导下氮饥饿Pba。因此,卡拉和碳水化合物基因编码[氨基甲酰磷酸合酶是上调氮饥饿文化不论接种滴定度。这意味着同化氮Pba在化验条件下是纳入核酸新陈代谢。
综上所述,我们的调查表明,氮应激反应可能是由两个截然不同的类型。两种类型的差异与动态的人口密度(增加或减少)根据接种滴定度,和不同的监管机构参与激活固氮酶的复杂。共同特征的两种自适应策略相关交叉保护表型的形成,诱导固氮酶复杂NtrC-independent方式和基因的上调,哪些产品参与整合同化氮成核苷酸。描述自适应nitrogen-deficiency-induced优化细胞的密度不是与严格的激活与响应相关的基因和相关rpo基因与类似的反应发生在碳饥饿。
本研究支持的俄罗斯科学基金会项目15-14-10022。