差异蛋白质组学分析的应激反应在茶树茶树(l)o . Kuntze]

文摘

茶树(茶树(l)o . Kuntze)对低温敏感,易受伤害的压力。检查茶叶冷却压力的反应,蛋白表达的变化进行了分析使用蛋白质组学的方法。一岁大的茶叶种植治疗在4°C 24 h,然后恢复24 h。通过分馏,近似1000个蛋白质斑点CBB-stained二维凝胶上分离和可视化。总共有10个蛋白点增加,9是减少和4蛋白质被诱导。MALDITOF / TOF质谱分析允许18个差异表达蛋白质的鉴定,包括众所周知的和小说coldresponsive蛋白质。冷却期间蛋白质显示增强的退化压力,特别是光合作用的蛋白质。确定蛋白参与几个流程,如信号传导、运输、疾病/防御,光合作用、氮和碳水化合物,能源、嘧啶和新陈代谢。这项研究提供了新的见解的复杂分子网络内茶叶参与适应冷却压力和压力信号。

关键字

茶树(l)o . Kuntze;二维电泳;蛋白表达;蛋白质组;令人心寒的压力

Abbrevations

汪:ADP-Ribosylation因素;大:Brefeldin A-inhibited鸟嘌呤nucleotideexchange蛋白质;IEF:等电点聚焦;描述:Oxygen-Evolving复杂;OEE:氧-蛋白质进化增强剂;及:肽质量指纹图谱;RcbL:二磷酸核酮糖羧化酶大亚基;2 de:两维电泳

介绍

低温是影响植物生长和农业生产严重的环境压力。它不仅抑制代谢反应也引起渗透,氧化和其他损害赔偿(1]。令人心寒的温度范围从0到12°C是常见的在作物生长季节,可以大大地减少植物生产力(2]。植物响应和适应的压力通过各种生化和生理过程,从而获得压力宽容。毫不奇怪,这些机制是复杂的,包括生理和生化反应的改变,基因表达和蛋白质合成3,4]。

比较蛋白质组学研究的基础上分析对比强调植物基因型和有条件非常丰富,给洞察植物对环境刺激的反应。基于二维蛋白质组学工具电泳(2 de)和质谱(MS)提供了一个有效的方法来研究植物的分子反应压力(5]。蛋白质组学方法也被应用于找到[6 -通用压力相关的蛋白质8]。差异蛋白质组的分析应用两种方法寻找特定蛋白质的微分表达式,然后由肽质量指纹识别(及)已广泛应用于许多领域的研究,有大量的重要成果(9 -11]。这些蛋白质识别压力通常归因于宽在许多植物代谢途径受到压力。已经受到了人们足够的重视,近年来在植物蛋白质组学的研究。蛋白表达响应非生物压力的变化研究了在玉米12)、大米(13)和大豆(14]。

茶树(茶树(l)o . Kuntze),属于家庭山茶科,是中国最重要的经济作物之一,印度、斯里兰卡、肯尼亚等(15]。作为经济作物是高度主观的冷应激,冷适应的分子机制/电阻收购一直十分关注的(8,16]。到目前为止,小的工作已经进行了揭示蛋白质组变化下的压力。最近,蛋白质组学分析已经开始解决植物背后的生化和分子机制应对的压力。在这项研究中,我们分析了差异蛋白质表达谱的茶叶使用Yingshuang,耐寒品种,确定冷却应力下的差异表达的蛋白质。本研究的数据将提供新的见解的分子机制的反应茶植物的压力。这项研究还提供了有价值的信息,将为进一步的研究奠定基础的功能基因,回应的压力。

材料和方法

植物材料和治疗

健康的和统一的一岁大的克隆苗茶(c . sinensis简历。Yingshuang)被用于这项研究。“Yingshuang”具有较强的抗压力和高收益。植物都生长在生长室25/23°C(白天/晚上),photonflux密度350 - 400μmol m-2s-1, 16小时光照,60 - 80的相对湿度。这些植物在4°C治疗24 h,然后恢复24 h。低温治疗开始后1 h(照明通过设置温度4°C,达到了大约30分钟后。返回的温度是25°C治疗24小时后。第三个叶子的植物被固定在液态氮,存储在-80°C冰箱和用于实验。

相对电解质泄漏试验

树叶被切成1厘米的段,用超纯水清洗三次。段被放置在管包含20毫升的超纯水和孵化25°C。两个小时后,导电性洗澡的解决方案(Lt)测量。然后在100°C管被孵化20分钟和电导率(10)再次测量。相对电解液泄漏是由公式计算Lt / L0 x 100%。五为每个样本进行复制。

蛋白质的提取和二维电泳

叶蛋白质提取使用修改后的三氯乙酸/丙酮过程[8]。蛋白质颗粒溶解在补液(8 M尿素,2%的家伙,0.5% IPG缓冲区,2.8毫米德勤)在室温下。在13000转离心后60分钟在4°C,蛋白质上层清液收集和储存在-80°C到使用。使用布拉德福德的蛋白质含量测定方法[17]。2 de的液体补液缓冲区(8 M尿素,4%的家伙,0.2% w / v载体两性电解质,65毫米德勤)包含405μg蛋白质用于水合物带16 h。Ettan IPGphor系统和pH值4 - 7 IPG条(17厘米,线性,Amersham生物科学)被用于等电点聚焦(IEF)。进行sds - page凝胶12%使用千变万化II xi细胞系统(Bio-Rad)。电泳是在16岁马/凝胶30分钟,然后24 mA /凝胶。蛋白质被CBB g - 250检测到。至少一式三份凝胶对每个样本进行。

凝胶扫描和图像分析

二维凝胶进行扫描使用UMAX PowerLook 2100 xl扫描仪(Willich,德国)。图像分析实现了使用一个8.0软件(Bio-Rad)。自动检测和匹配后,手工编辑。三个分离胶的样品被用来创建“复制组”。统计,定量和定性分析集”了对照组和每个治疗组之间。在学生的数据集,t检验和显著性水平(95%的人选择。定量设置的上限和下限设置为1.5和0.5,分别。布尔分析集创建数据集和定量或定性之间的集。图像分析后,选择相应的利息凝胶点进行进一步分析。

MALDI-TOF / TOF MS分析和数据库搜索

选中的点手动恢复预备CBB彩色凝胶,使退色1 h在室温下使用刚做好的清洗解决方案组成的100%乙腈/ 50 mM碳酸氢铵(NH4 HCO3) (50:50 v / v)。胰蛋白酶消化和MALDI-TOF/ TOF分析进行描述之前[18]。消化蛋白质样本混合矩阵的解决方案(7毫克/毫升α-cyano-4-hydroxycinnamic酸在ACN组织0.1%和50%),然后lμL混合物被发现到目标板上。质谱是MALDI-TOF / TOF串联质谱仪,ultrafleXtreme。

仪器在reflectron运营模式。数据库搜索及和MS / MS进行使用吉祥物2.3.02软件(矩阵科学、英国伦敦)。数据库是国家生物技术信息中心(NCBI) nonredundant包含2464940序列包括154691序列的绿色植物。PDB(蛋白质数据库)的葡萄、柑橘、杨柳科,茶树,用于执行序列比对。

结果

茶叶的相对电解质渗漏

质膜充当主网站和应对环境变化。然而,或多或少严重的压力常常破坏细胞膜,导致泄漏。电解质的渗漏是广泛使用作为膜损伤的测定(4]。定量地评估冷却应力的不利影响,我们表现的相对电解质渗漏试验。所示图1相对电解质泄漏从14.9%上升到18.5%,冷却24小时后治疗。泄漏降低并接近基准面24 h后的复苏(13.9%)。的相对电解质泄漏从叶子明显不同(p < 0.05)之间的0 h和24小时治疗,表明茶叶暴露在4°C 24 h已经遭受负面影响。

二维电泳分析总蛋白质的茶叶

研究蛋白质的变化资料冷却压力期间,我们进行了二维分析总蛋白质的茶叶从三个生物复制。至少一式三份凝胶为每个样本进行,他们表现出高水平的再现性。代表凝胶所示图2一个和2 b代表的地位差异表达蛋白质点在二维凝胶两种登记入册。大多数蛋白质斑点分布之间的π4和7.0π。超过1000个蛋白质斑点可再生产地探测到一个8.0软件CBB-stained凝胶。其中,23点大大改变了相同的地方观察到0 h时间点(P < 0.05)。这些差异表达的蛋白质包括10点的大小增加,9点的大小减少(图2 c4)和新出现斑点。三个典型的点放大图2 d。注意,虽然有些地方也减少或增加24 h后的复苏(R2 4 h),这些变化不太明显比0 h时间点。

鉴定和功能分类的差异表达蛋白质

确定显示的差异蛋白质,蛋白质斑点从制备凝胶,切除为胶液通过胰蛋白酶消化,然后分析了MALDI-TOF / TOF女士总共18个差异表达的地方被成功鉴定及其值的变更与控制相比值。蛋白质的功能注释进行了使用Blast2GO程序对冗余蛋白质数据库(NR;NCBI)。一些鉴定蛋白质注释未知和假设的蛋白质或蛋白质数据库中没有特定的函数。获得关于这些蛋白质的功能信息,我们搜查了他们的同系物BLASTP (www.ncbi.nlm.nih.gov /爆炸)使用他们的蛋白质序列。四个相应的同源性最高的同系物。所有的景点共享超过79%阳性与同系物氨基酸水平,表明他们可能有类似的功能。除了未知蛋白,确定蛋白质的其余部分被分为几个功能类别(图3)。

几个蛋白质含量增加的压力

冷却压力调节几种蛋白质的积累。这包括增加大量的蛋白质有关光合作用,如核酮糖1 5 5-bisphosphate,羧化酶/加氧酶大亚基(RcbL点305年、306年和440年),核酮糖1 5 5-bisphosphate,羧化酶/加氧酶小亚基(二磷酸核酮糖羧化酶)(点422年和424年)。它还包括了大量的蛋白质与能量和氮新陈代谢,如叶绿素ATP合酶β亚基(现货159)和茶氨酸合成酶(292点)。

冷却压力诱导的积累oxygen-evolving增强蛋白质(OEE现货146),苹果酸脱氢酶家族蛋白质(187点),预测:CEN-like蛋白2(现货182)和一个未知的蛋白质命名为假想VITISV_033259(现货25)。

蛋白质含量下降的压力

冷却后的结果表明,减少光合作用压力治疗可以归因于(1)蛋白质的水平在卡尔文循环的酶,如RcbL(点365年、395年和400年),(2)一个假想的蛋白质参与代谢(87点),(3)蛋白参与运输,如预测:brefeldin A-inhibited鸟嘌呤nucleotide-exchange蛋白2(301点),假设蛋白POPTR_0002s09680g(390点),(4)一个不愿透露姓名的蛋白质产品(166点)参与疾病/防御。

几个有趣的差异表达蛋白质似乎先生降解的产品,因为他们的观察值小于理论值。具体情况是光合作用的蛋白质,包括二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(RcbL),二磷酸核酮糖羧化酶小亚基,oxygen-evolving增强蛋白质。两种蛋白质被确定在多个地方切除从相同的凝胶(图2)。第一个蛋白质是RcbL (gi | 388893215,胃肠道| 118917738和胃肠道| 555945924)。它被确认在六个蛋白质斑点,说明转译后的修改或退化的发生。点的观察分子质量小于理论。第二个蛋白质二磷酸核酮糖羧化酶小亚基,在两个点确定(点422年和424年)。

讨论

在这项工作中,我们试图研究蛋白质组的变化参与chilling-induced茶叶使用蛋白质组学方法。总共有18个蛋白质表达水平差显示成功发现了在寒冷的压力。确定蛋白主要参与几个过程,即。信号转导、光合作用、运输、和疾病/国防和碳水化合物代谢。不同蛋白质及其表达模式相关的应激反应是下面讨论。

组蛋白参与光合作用的变化

光合作用是一个关键植物的过程受到压力的影响(9,19,20.]。光合作用的速率通常减少暴露在各种压力中高等植物(21]。在这项研究中,大多数photosynthesis-related蛋白质的表达模式是复杂的。chilling-stressed幼苗的茶,二磷酸核酮糖羧化酶小亚基被发现差异。虽然RcbL表达式(305年,306年和440年)在24小时时间点增加,其他RcbL表达式被降低了。二磷酸核酮糖羧化酶片段显示不同的表达模式在增长(22]。此外,我们的研究结果还表明,一些光合蛋白在茶叶被部分降解。我们的结果类似于前面的报道,冷应激下的水稻花药蛋白质组的分析确定7蛋白质分解产物(19]。这些结果表明,低温增强蛋白质降解。一个典型的例子是RcbL 6片段被确定在本研究中。退化RcbL也在其他蛋白质组研究报告(22- - - - - -24]。的压力下,OEE诱导,它被认定为蛋白质与oxygen-evolving复杂(OEC)。OEE表达的增加似乎与寒冷损伤引起的脱水。与我们的研究结果相似,Abbasi和小松25]发现OEE2的表达是氯化钠和ABA诱导的水稻叶鞘。提高盐胁迫下表达OEE2据报道在红树林,众所周知,OEE2 OEE3可以很容易地从PSII复杂在氯化钠的存在(16]。

群蛋白质代谢的变化响应的压力

代谢相关蛋白质组的变化观察ATP合酶β亚基(159点),苹果酸脱氢酶家族蛋白质(187点),茶氨酸合成酶(292点)和假想蛋白POPTR_0012s04020g(87点)。

在我们的研究中,冷却压力增强的ATP合酶β亚基的表达和苹果酸脱氢酶家族蛋白质,两种酶参与代能源和碳水化合物代谢,分别。这意味着他们的增强可能有助于产生更多的能量需要的非生物压力。茶氨酸合成酶(TS,现货292),发生在根和射击,是压力的增加。影响蛋白质的积累积极的压力。与此同时,最近的研究表明,茶氨酸的生物合成,来自茶植物氮代谢,可能受到盐治疗(20.]。

相比之下,一个假设的蛋白质POPTR_0012s04020g(87点)冷冻治疗后下降。它显示一个同源性(79%)和预测蛋白质dihydropyrimidine脱氢酶(辅酶ii(+))的地方。Dihydropyrimidine脱氢酶(DPD)的初始和病原反应酶尿嘧啶异化的途径(26]。蛋白质的表达的减少意味着冷却压力导致代谢改变。

组蛋白的变化参与信号转导和疾病/防御

一个候选人组件参与信号转导是预测CEN-like蛋白2(182点)。这是茶叶诱导治疗24小时后。Mimida [27孤立和比较了植物磷脂酰ethanolamine-binding proteinlike基因终端FLOWER1式和CENTRORADIALIS式,这是参与拍摄的控制分生组织身份和开花时间。

一个不愿透露姓名的蛋白质产品(166点)被发现在冷却压力下降。这位不知名的产品是同源蛋白质预测出局区ATP-dependent RNA解旋酶50-like,这已被证明与细胞防御反应(28,29日]。CsdA,证明是这个家庭的一员,可以通过冷休克诱导(30.]。RNA解旋酶的出局区家庭中发现几乎所有的生物和有重要的作用RNA代谢(31日]。

参与运输的蛋白质组的变化

两个假设的蛋白质包括POPTR_0002s09680g(现货390)和BIG2-like(301点)被发现是减少chilling-stressed树叶。我们发现POPTR_0002s09680g显示高同源性核糖体结合蛋白(RRBP)萝藦。RRBP1 (Q9P2 E9, EN SP0 000036704 4.1)是一个内质网的膜蛋白(32,33]这是必不可少的核糖体绑定和易位的新生蛋白质在内质网的膜(34]。

另一个候选人组件参与交通预测是大2。ADP-ribosylation因素(arf)水泡贩卖的关键。Brefeldin A-inhibited鸟嘌呤nucleotide-exchange蛋白(大)1和2激活arf通过加速更换绑定GDP与三磷酸鸟苷(35- - - - - -39]。

结论

摘要分子反应的压力是在茶树的蛋白质水平调查。差异表达蛋白质识别的比较蛋白质组学方法在确定冷却压力几个过程,主要包括交通、疾病/国防、光合作用、碳水化合物、能量和氮代谢。还有一些小说和独特的植物蛋白质中确定茶。研究结果将有助于进一步推动工作发展的策略获得了全面的知识机制茶植物。

确认

这个主题由青岛市民生工程补贴(13 - 1 - 3 - 85 - nsh)的繁殖项目山东(2014年2012号lz12-03 2013 lz12-03 lz12-03)和山东省现代农业产业技术体系(SDAIT-21)。

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