扩散释放Photosensitizing代理(PS)从小说PVA-Borate半固态药物载体在体外口服变异链球菌生物膜

文摘

背景:变形链球菌,人类龋齿的代理之一,尤其有效地形成生物膜在人类口腔硬组织;本研究的目的是调查和量化的扩散释放photosentising代理(PS):亚甲蓝(MB), toludine蓝(TB),玫瑰红(RB)和甲基橙(MO)与聚乙烯醇(PVA)硼酸半固态凝胶的体外口服变异链球菌生物膜。方法:变异链球菌生物膜生长被确定,以确保适当的牙菌斑的形成和使用共焦显微镜的特点。发布概要文件为MB,结核病,RB和MO-loaded PVA-borate半固态生物膜在缺乏直接的同行相比,变异链球菌生物膜的存在。此外,他们的扩散系数和抗性测定。结果:共焦成像结果表明,生物膜生长在5天时间内通常有一个不间断的电影殖民地占领整个面积增长的尼龙网支持约60µm表面生物膜的大小。所有的整体扩散阻力PVA-borate半固态的变异链球菌生物膜的扩散阻力约为1.2倍,低于PVAborate半固态缺乏生物膜。扩散电阻研究了PS,表明静电作用力和分子大小发挥重要作用和持续的药物控制释放PVA-borate半固态。结论:PVA-borate半固态小说PSs运营商可能会提供一个创新的交付系统对变形链球菌在治疗。

关键字

Photosensitizing代理商;生物膜;半固态

介绍

牙菌斑生物膜的积累中发挥着重要作用的发病机制龋齿、牙龈炎和牙周炎。可行的微生物群落和复杂的生态关系影响居住环境被认为是由口腔细菌人口(1]。牙齿的主要病原体生龋齿的变形链球菌生物膜的形成,产生乳酸的代谢产物糖发酵糖长吞下食物后(23)。此外,生龋齿的细菌积极吸收氧气,导致缺氧环境,有利于厌氧病原微生物的扩散(4]。

根除概念支撑牙菌斑是交付治疗剂量的抗菌剂(s),确保完整的生物膜的渗透,因此细胞死亡。然而,许多当前使用的常规牙科运载系统很容易稀释,从而减少粘膜保留治疗药物的能力;此外,细菌抵抗抗生素的问题牙科斑块根除仍然是一个引起人们的关注。

PS的成功交付,作为一个关键的组件在光动力治疗,牙斑,将导致细胞毒性活性氧的生成,这将导致微生物细胞死亡。即使PS也亲脂性的和制药配方注射用通常很难制定、PSs的加载PVA-borate半固态输送系统是适合于局部和皮肤的应用程序。

水凝胶已被广泛应用于广泛应用在临床实践和实验医学,尤其是在矩阵控制药物输送和组织工程5- - - - - -8]。当前流行的这些材料是基于他们巨大的化学具有不同属性的通用性和水凝胶的生产(7,8]。交联PVA水凝胶被广泛的研究,与多个应用程序指向他们的应用程序药物输送车辆(9,10]。控制和持续给药仍是一个发展和有趣的领域二十多年。治疗药物浓度在长时间实现和维护,确保药物作用的效果。扩散系数是一个有用的测量控制药物的释放,特别是当评估PS从交付水凝胶系统的释放,如PVA-borate半固态材料。

本研究的目的是调查的释放photosensitizing代理(PS)从PVA-borate半固态的存在变异链球菌。生物膜是利用共焦成像特点。发布概要文件的亚甲蓝(MB), toludine蓝(TB),玫瑰红(RB)和甲基橙(MO),加载到PVA-borate半固态确定在一个控制环境和存在变异链球菌生物膜。此外,整体的贡献PVA-borate半固态材料持续释放和潜在的影响在体外变异链球菌生物膜的PS估计使用相应的扩散电阻。

材料和方法

材料

聚乙烯醇(PVA)(98%的水解,M_w= 13000 - 23000 D_一个),四硼酸钠十水合物(硼砂,99.5 10.5.0%)和photosensitizing代理(亚甲蓝(MB), toludine蓝(TB),玫瑰红(RB),甲基橙(MO))(99%)都获得Sigma-Aldrich(吉林厄姆,英国)。所有试剂都是适当的实验室标准和使用前未经纯化。水净化的Purelab®超系统(R≥18 MΩ厘米)。

Photosensitizer-loaded制备半固态系统

股票的解决方案包含20% w / w w / w PVA和5%硼砂是准备在去离子水中,加热在80°C,直到完全溶解。测试配方含有10% w / w PVA, 2.5% w / w硼砂和大约3毫米的MB,结核病,RB和莫。PS之前添加了硼砂溶液之前PVA。的形成PS-loaded半固态重形成后,任何损失补偿的去离子水。PS-loaded水凝胶保持进一步48 h在柔和的照明,直到进一步的使用。

生物膜的形成

单一物种生物膜是准备使用变异链球菌英国贝辛斯托克(国家反恐怖主义中心的10449年,Oxoid)。变异链球菌亚文化的心浸液琼脂(投资法、Oxoid),储存在-70°C,直到进一步的使用。一夜之间使用两到三个殖民地文化的浸染成10毫升脑心浸液媒体(嗨,Oxoid),孵化在37°C,用颤抖的在200 rpm的浊度24 h。一夜之间文化然后调整使用无菌BHI给10的细胞密度⁸CFU毫升¹。变异链球菌被种植在六无菌20μm尼龙网(20毫米吗²HIA过程),放在一个盘子和三个控制一个单独的板块。20μl暂停调整隔夜文化和20μl BHI被放置在每个网格的中间。接种和控制的培养5天在37°C。

共焦成像

BioRad mrc - 600共焦扫描显微镜,配有10 x油浸物镜是用来证实生物膜生长在尼龙网的住所。变异链球菌生物膜是染色使用BacLight®荧光生存工具包。彩色尼龙网格安装到微观滑动检测使用氩激光(476海里),收集和部分在20μm间隔。荧光强度共焦图像是一种间接测量的生物膜的存在的社区。

在体外释放研究

释放的研究模型PS在人造膜(尼龙网)研究了使用弗兰兹扩散细胞(PermaGea, Inc .)、美国)。PS版的解决方案,在解决方案+生物膜,从半固态,从半固态+生物膜进行了研究。细胞的扩散面积是1厘米²,孔的直径11.28毫米和15毫升的接收机音量。受体阶段充满了磷酸缓冲盐(pH = 5.8),一张尼龙网(最初浸泡24 h受体媒体)夹供体和受体之间的阶段。PS-loaded半固态(1.00 g)放置在捐赠阶段和紧闭保鲜膜®,以避免水蒸发。受体相搅拌磁和恒温器在32±0.02°C,循环的夹克。在定义的时间间隔,0.1毫升的接收机阶段被删除,取而代之的是新鲜的缓冲和PS药物浓度spectrophotometrically决定。结核病,激发波长为620 nm和排放的范围是627到720纳米。RB,激发波长为552 nm和排放记录范围从555到620纳米。MB,发射的激发波长为665 nm和692 nm。密苏里州,激发波长263 nm,排放在420海里。

统计分析

确定PS发布概要文件从PS-loaded通过控制网格和网格包含半固态在体外变异链球菌生物膜中,数据被表示为六个实验的均值+标准差。f₂相似因子(方程1)是用于建立任何显著差异(11发布概要文件之间),PS的PVA-borate半固态(没有生物膜)和生物膜的存在。

(1)

发布测试进行了至少六次均值±SD报道,其中n是抽样数,R_t和T_t代表药物的比例控制和测试产品的溶解时间,t·f₂0到100之间的相似性系数符合结果,因此两个版本配置文件被认为是类似的,当f₂≥50岁。

结果

本研究评估中使用变形链球菌生物膜形成20日μm尼龙网。生物膜的形成是测量超过5天,以荧光核酸染色并使用共焦成像的视觉。生物膜的荧光染色尼龙网透露了一个惊人的变化变异链球菌形成生物膜的能力。图1在5天内,结果表明,生物膜的形成了一层几乎不间断的殖民地占领尼龙网的整个表面区域增长表面相比,控制。同时,共焦成像表明,一个60μm厚生物膜占领了5天的尼龙网,证明了荧光信号扩展到深度100μm生物膜占领网,虽然没有观察到的荧光信号低于40μm控制治疗。

实验受体间的PS作为时间的函数所示图2。绘制曲线展示在不同的时间累积药物释放,表明在6 h, 0.61±0.03, 0.59±0.01, 2.53±0.13, 1.02±0.06 mg.ml⁻¹MB、结核病、RB和莫释放PVA-borate半固体,分别。相比之下,PS的累积释放PVA-borate半固态的存在在体外变异链球菌生物膜在6小时、0.51±0.02、0.48±0.01、2.38±0.09,0.92±0.08 mg.ml⁻¹分别MB、结核病、RB和密苏里州。使用f₂相似因子,它可以显示有显著差异在MB和结核病的发布概要文件解决方案从PVA-borate半固态。在所有其他情况下,没有显著差异(f₂> 50)发布概要文件的RB和莫配方。

估计的有效扩散系数是很重要的,因为它可以提供一个有用的药物释放机制的描述复杂的多相输送系统,如PVA-borate半固态。有效扩散计算使用修改后的Higuchi [12方程(方程2)。

(2)

膜的传质扩散阻力的确定(方程。3),维_eff适当的扩散系数和δ_米薄膜厚度测量的质量转移的方向。

总传质阻力从PVA-borate半固态(方程。4)和生物膜(方程5)也被计算,总半固态样品厚度和膜,扩散系数适用于PSs包含PVA-borate半固态和生物膜。

(4)

(5)

表1显示各种PS通过尼龙网状膜扩散系数和相应的质量电阻(s)从一种或两种PVA-borate半固态变异链球菌生物膜。

表1。配方的扩散系数和电阻photosensitizing代理在尼龙网状膜。

扩散系数的高价值获得了甲基橙(12.6±0.05 10²厘米²h⁻¹)可能是由于整体分子中性电荷相比,带正电的MB(5.02±0.02厘米²h⁻¹)和结核病(4.75±0.02厘米²h⁻¹),因为他们有大约相同的分子量。RB扩散系数(40.2±0.02厘米²h⁻¹)低于莫,这可能是由于其整体负电荷和大小的三倍。药物释放的机制被纳入评估第一个发布数据的60%,根据Korsmeyer-Peppas方程释放指数(n)的药物释放机制的说明。这个地区,最初的高通量是排除在n的决心。图3显示在体外通量的PS PVA-borate半固态的存在在体外变异链球菌生物膜。结果显示高通量的初始区域(一个小时),在所有的配方。

为了保持一致,第一个小时释放PS的配方被排除在释放指数的测定。药物传输机制中观察到局部配方释放价值指数为0.5,0.5 < n < 1.0、1.0和n > 1.0,十解释为Fickian扩散,非Fickian扩散、II运输和Super-case II运输,分别。结果表2显示,PS版的发布指数价值从运输的配方及其可能的机制。MB的释放,结核病和RB PVA-borate半固态的解释是通过super-case II运输,而莫发布是通过non-Fickian扩散。此外,MB的释放和结核病从PVA-borate半固体的存在变异链球菌生物膜可以被解释为通过non-Fickian diffu-sion, RB和莫释放是通过Fickian扩散。

表2。Korsmeyer-Peppas释放参数和溶质释放photosensitizing代理机制持续释放PVA-borate半固态

的影响在体外变异链球菌生物膜的渗透系数和药物运载工具显示了不同的光敏剂图3。结果表明,无统计差异的渗透系数在空白的pres-ence网或敏化在体外变异链球菌biofilm-coated网。然而,更高的价值是定量估计释放的PS PVA-borate半固态在缺乏生物膜的情况下,相比同行的存在在体外变异链球菌生物膜。

讨论

微生物生物膜相互社区坚持支持面,通常由一个封装细胞外多糖矩阵[屏蔽13]。这种生物膜将构成障碍有效的药。这是特别相关的抗菌化疗,其目的是为了实现杀菌浓度在整个生物膜,特别是在最大的药物输送系统。因此,生物膜厚度是一个重要的参数对于任何新的治疗方法,如交付的敏化光动力抗菌化学疗法的一部分。为了获得评估生物膜厚度在扩散,a变异链球菌生物膜生长的惰性,但多孔,支持。在这项研究中表明的结果变异链球菌生物膜能够生长在合成与深度60μm尼龙网。

在这项研究中我们用玫瑰红和甲基橙与phenothiazinum-based PS(亚甲蓝和toludine蓝色)。MB的有机属性和整体的正电荷和结核病给他们优势在RB和密苏里州,在这项研究中使用。有机染料具有荧光和photosensitizing属性,这已被证明有效的灭活许多细菌和病毒在光照(14,15),有机染料的整体正电荷可以促进绑定有杀死细菌影响(16]。Soukos et al。17]表明电荷由阳离子poly-L-lysine氯e6共轭负责增加吸收和共轭纯文化的明显的光毒性Porphyromonas gingivalis和a . viscosus。

一般而言,扩散行为复杂聚合物输送系统可分为根据聚合物的类型和渗透的相对移动(18]。MB的释放,结核病,RB PVA-borate半固态通过super-case II交通(释放药物远远大于其他弛豫过程),同时释放RB和莫PVA-borate半固体的存在在体外变异链球菌生物膜是通过Fickian扩散(渗透剂和聚合物段(s)的释放具有可比性)。不过,密苏里州的释放PVA-borate半固态,结核病和MB PVA硼酸半固态的存在在体外变异链球菌生物膜是通过non-Fickian扩散(渗透剂的扩散速度远低于聚合物的成分)。

有效的局部药物治疗需要足够的药物吸收,在一段特定的时间内最大的治疗反应。在这个研究结果表明,在所有情况下,PS的累积释放PVA-borate半固体增加6个小时的调查期间,相比PS的破裂释放的解决方案,这是最明显的在第一个小时(图2一个- - - - - -二维)。这些结果表明,PS的累积释放PVA-borate半固体的可能有效的第一个小时内使用,然而在溶液中释放的PS和PVA-borate半固体显示释放的存在率降低在体外变异链球菌生物膜,相比在溶液中释放PS或PS-loaded PVA硼酸半固态缺乏生物膜。这种现象可以解释,因为之间的交互photosensitizer-polymer (PSs和带负电聚合物在在体外变异链球菌生物膜细胞表面)。

PS发布概要文件的解决方案的结果,从PVA-borate半固体的显示,甲基橙有破裂释放相比,在这项研究中使用的其他敏化。比例相对较低的累积释放MB和结核病RB和密苏里州相比,表明释放MB和TB-loaded PVA-borate半固态通过静电引力的力量结合在一起,支持其他发现类似PS制定各种交付系统(19,20.]。例如,Serizawa et al。20.]研究了铬变素的释放2 r和Indoine蓝色染料从保利(烯丙胺盐酸盐)电影,利用紫外可见光谱,表明两铬变素的装载和释放2 r和Indoine蓝色染料从电影取决于之间的静电吸引和排斥的力量发生酸−基官能团在电影和染料。因此,吸引带负电荷之间的静电力PVA-borate半固态和带正电的MB和结核病,最终导致PS的总量释放被减弱。与部队之间的斥力负电PVA-borate半固体和带负电荷的RB导致随后的突然释放。扩散系数的高价值获得了甲基橙与带正电的亚甲蓝相比,可能归因于其整体中性电荷,尽管他们的分子量相对较相似。亚甲蓝和toludine蓝色拥有积极的总负责;他们也有类似的分子量价值占他们的相似的有效扩散系数值。玫瑰红拥有全面的负电荷,甲基橙的近三倍。这两个因素可能导致扩散系数略低,在RB相比。

重要的是要理解的通量率和渗透率系数提出了药物从交付系统,以确保治疗的剂量管理目的。图4显示了所有使用的敏化的四种类型有类似紧随其后的是一个快速和稳定的释放减少。最初的高通量可以归因于一个初始破裂效应,发生在很短的时间内,不可预测的,通常发生在凝胶运载系统由于迁移所带来的更高的表面浓度的药物表面(21]。通量持续大约一个小时后到达一个更稳定的概要文件。影响系统引起的肿胀和形成平衡与周围的环境可能是定语。然而,敏化的大版本的发布概要文件可以解释为有益的,表明可能快速影响配方对口腔病变。为了实现最优的光疗制定口腔病变,光敏剂的类型和释放率是很重要的。这是因为发布必须足够高,以诱导后的一小时内政府光疗效果。如果光敏剂的类型是唯一的管理因素在决定phototherapeutic活动,那么任何PS将被选中。然而,问题已经与玫瑰红有关,例如,Schaap et al。22)发现,在溶液中自由浮动的敏化的产量要高100倍单线态氧,而固定化玫瑰红,这可能是由于在玫瑰bengal-loaded聚合物扩散问题。莫另一方面吸收在465纳米以下方式成功的光动力治疗窗口过程。此外,庸et al。23]研究表明饱和莫作为PS没有达到。因此,选择一个合适的PS,之间的权衡能力吸收在光疗(600 - 900海里),photo-toxicity和药物释放必须实现的目标,使进一步研究phenothiazium-based PS合适的候选人作为替代局部治疗变异链球菌。

确认

作者承认金融支持部门的就业和学习(DEL)在阿尔斯特大学的英国。

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