新型pva -硼酸盐半固体药物载体通过体外口服变形链球菌生物膜扩散释放光敏剂(PS)

摘要

背景:变形链球菌(Streptococcus mutans)是导致人类龋齿的病原体之一，尤其能在口腔硬组织上形成生物膜;本研究的目的是研究和量化光感受剂(PS):亚甲基蓝(MB)、甲苯胺蓝(TB)、玫瑰孟加拉(RB)和甲基橙(MO)在聚乙烯醇(PVA)-硼酸半固体凝胶中在体外口腔变形链球菌生物膜存在时的扩散释放。方法:确定变形链球菌生物膜的生长，以确保适当的牙菌斑形成，并使用共聚焦显微镜进行表征。在没有生物膜的情况下，直接比较了MB、TB、RB和mo负载pva -硼酸半固体的释放谱，并与存在变形链球菌生物膜的情况进行了比较。并测定了它们的扩散系数和阻力。结果:共聚焦成像结果显示，生长超过5天的生物膜具有一般不间断的菌落膜，占据了大约60微米生物膜大小的尼龙网支撑生长表面的整个表面积。所有pva -硼酸半固体在存在变形链球菌生物膜的情况下的总体扩散阻力比没有生物膜的pvva -硼酸半固体的扩散阻力低1.2倍左右。所有研究的PS的扩散阻力表明，静电力和分子大小在pva -硼酸半固体的药物控制和持续释放中起重要作用。结论:pva -硼酸半固体作为新型PSs载体，为治疗变形链球菌提供了一种创新的给药体系。

关键字

Photosensitizing代理商;生物膜;半固态

简介

牙菌斑生物膜的积累在龋齿、牙龈炎和牙周炎的发病机制中起着重要作用。微生物群落具有复杂的生态关系，影响居住环境被认为是由口腔细菌人口(1］．牙齿生物膜形成的主要病原体是致龋性变形链球菌，它在吞咽食物很长时间后，会产生乳酸作为糖发酵糖的代谢产物[23)。此外，龋齿细菌积极吸收氧气，形成缺氧生态位，有利于厌氧病原微生物的增殖[4］．

支撑牙菌斑根除的概念是提供治疗剂量的抗菌剂，以确保完全的生物膜穿透，从而导致细胞死亡。然而，目前使用的许多常规牙科给药系统很容易在口腔中被稀释，从而降低了治疗药物的粘膜保留能力;此外，抗菌药物的细菌耐药性问题牙科斑块根除仍然是一个值得关注的问题。

PS作为光动力治疗的关键成分，成功递送到牙菌斑将导致细胞毒性活性氧的产生，这将导致微生物细胞死亡。即使PS也是亲脂性的，并且用于肠外给药的药物配方通常难以配制，pva -硼酸盐半固体给药系统中PS的负载将非常适合局部和透皮应用。

水凝胶在临床和实验中有着广泛的应用医学的矩阵控释药物组织工程[5-8］．这些材料目前的流行是基于它们巨大的化学用途和不同性质的水凝胶的生产[7，8］．交联聚乙烯醇水凝胶已被广泛研究，有几个应用针对其应用药物输送车辆(9，10］．二十多年来，控制和持续给药一直是一个先进和有趣的领域。治疗药物浓度达到并维持较长时间，确保药物作用的有效性。扩散系数是控制药物释放的一个有用的衡量标准，特别是在评估从pva -硼酸半固体材料等传输水凝胶系统中释放PS时。

本研究的目的是研究pva -硼酸半固体中光敏剂(PS)的释放变异链球菌．利用共聚焦成像对生物膜进行表征。亚甲基蓝(MB)，甲苯胺蓝(TB)，玫瑰孟加拉(RB)和甲基橙(MO)，加载到pva -硼酸半固体中，在对照环境和存在变异链球菌生物膜。此外，pva -硼酸半固体材料对缓释的整体贡献和潜在效应在体外变异链球菌利用生物膜在PS释放过程中相应的扩散阻力来估计。

材料与方法

材料

聚乙烯醇(PVA)(98%水解，M_w= 13000 - 23000 D_一个)，十水四硼酸钠(硼砂，99.5-10.5.0%)，光敏剂(亚甲基蓝(MB)， toludine蓝O (TB)，玫瑰孟加拉(RB)，甲基橙(MO))(99%)均从Sigma-Aldrich (Gillingham, UK)获得。所有试剂均符合实验室标准，使用时无需进一步纯化。水由Purelab®Ultra系统净化(R≥18 MΩ cm)。

光敏剂负载半固体体系的制备

在去离子水中制备含有20% w/w PVA和5% w/w硼砂的原液，在80°C加热至完全溶解。测试配方含有10% w/w PVA, 2.5% w/w硼砂和大约3mm的MB, TB, RB和MO。在加入PVA之前，将PS添加到硼砂溶液中。形成的ps负载半固体在形成后称重，任何损失通过添加去离子水来补偿。负载ps的水凝胶在昏暗的灯光下再保存48小时，直到进一步使用。

生物膜的形成

单物种生物膜的制备变异链球菌(NCTC 10449, Oxoid，贝辛斯托克，英国)。变异链球菌在心脏灌注琼脂(HIA, Oxoid)中传代培养，并在-70°C保存，直到进一步使用。用2 - 3个菌落接种过夜培养物到10ml脑心脏输注培养基(BHI, Oxoid)中，37℃孵育，200转/分震动24小时。然后用无菌BHI调整过夜培养物的浊度，使细胞密度为10⁸CFU毫升^－1．变异链球菌在6个无菌20 μm尼龙网(20mm²)，放在HIA板上，三个对照放在单独的板上。在每个网格的中间放置20 μl调整后的过夜培养悬浮液和20 μl BHI。接种组和对照组在37℃下孵育5 d。

共焦成像

使用BioRad MRC-600共聚焦扫描显微镜，配备10倍油浸物镜，确认尼龙网上生长的生物膜的驻留。变异链球菌生物膜染色使用BacLight®荧光活性试剂盒。染色的尼龙网安装在显微镜载玻片上，使用氩激光(476 nm)检查，并以20 μm间隔收集切片。来自共聚焦图像的荧光强度是生物膜群落存在的间接测量。

在体外释放研究

使用Franz扩散细胞(PermaGea, Inc.， USA)研究了模型PS在人造膜(尼龙网)上的释放。研究了PS在溶液、溶液+生物膜、半固体和半固体+生物膜中的释放情况。细胞扩散面积为1cm²，孔径为11.28 mm，受体体积为15 ml。受体相用磷酸盐缓冲生理盐水(pH=5.8)填充，在供体和受体相之间夹住一块尼龙网(最初在受体介质中浸泡24小时)。将ps负载的半固体(1.00 g)置于供体相中，并用Parafilm®紧密闭合以避免水分蒸发。将受体相磁搅拌并在32±0.02°C温度下加热，使用循环夹套。在规定的时间间隔内，去除0.1 ml的接收相，用新鲜缓冲液代替，分光光度法测定PS药物浓度。对于TB，激发波长为620 nm，发射范围为627 ~ 720 nm。对于RB，激发波长为552 nm，发射记录在555 ~ 620 nm范围内。对于MB，激发波长为665 nm，发射波长为692 nm。对于MO，激发波长为263 nm，发射波长为420 nm。

统计分析

通过控制网格和含有PS的网格，确定PS负载半固体的PS释放剖面在体外变异链球菌生物膜，数据用6次实验的平均值加标准差表示。f₂相似系数(方程1)，以确定任何显著差异[11]，在pva -硼酸半固体(在没有生物膜的情况下)和存在生物膜的情况下，PS的释放曲线之间。

(1）

至少进行6次释放试验，报告平均值±SD，其中n为抽样数，R_t和T_t表示对照品和试验品在同一时间内药物溶解的百分比，t.f₂相似因子拟合结果在0和100之间，因此当f₂≥50岁。

结果

本研究采用变形链球菌在20 μm尼龙网上形成生物膜。生物膜形成测量超过5天，用荧光核酸染色和共聚焦成像进行表征。荧光染色的生物膜在尼龙网显示了一个惊人的变异性变异链球菌形成生物膜的能力。图1，结果表明，与对照组相比，生物膜在5天内形成了几乎不间断的菌落层，占据了尼龙网生长表面的整个表面积。此外，共聚焦成像显示，在第5天，尼龙网被60 μm厚的生物膜所占据，荧光信号延伸到100 μm深度，而在对照处理中，40 μm以下未观察到荧光信号。

图中显示了PS在受体室中随时间变化的实验图2．不同时间的药物累积释放曲线显示，6 h时，药物累积释放量分别为0.61±0.03、0.59±0.01、2.53±0.13和1.02±0.06 mg.ml⁻¹pva -硼酸半固体分别释放MB、TB、RB和MO。相比之下，pva -硼酸半固体中PS的累积释放在体外变异链球菌6 h生物膜浓度分别为0.51±0.02、0.48±0.01、2.38±0.09和0.92±0.08 mg.ml⁻¹分别为MB、TB、RB和MO。使用f₂相似系数，可以看出pva -硼酸半固体在溶液中MB和TB的释放谱存在显著差异。在所有其他情况下，没有显著差异(f₂>50)。

有效扩散系数的估计是非常重要的，因为它可以为药物从复杂的多相给药体系(如pva -硼酸半固体)中释放的机制提供有用的描述。有效扩散计算采用修正的Higuchi [12方程(方程2)．

（2）

其中确定了膜对传质的扩散阻力(方程。3)，其中D_eff扩散系数和δ是否合适_米膜厚度是在传质方向上测量的。

pva -硼酸半固体的整体传质阻力(方程。4)和生物膜(方程5)，其中为半固体样品和膜的总厚度，为含pva -硼酸半固体和生物膜的PSs的适宜扩散系数。

（4）

（5）

表1，显示了PS通过尼龙网膜的各种扩散系数以及相应的pva -硼酸半固体和pva -硼酸半固体的质量阻力(s)变异链球菌生物膜。

表1。光敏剂在尼龙网膜上的扩散系数和电阻的配方。

甲基橙的扩散系数较高(12.6±0.05)^－2厘米²h⁻¹)，与带正电荷的MB(5.02±0.02 cm)相比，可能归因于整体分子中性电荷²h⁻¹)和TB(4.75±0.02 cm²h⁻¹)，因为它们的分子量大致相同。RB的扩散系数为40.2±0.02 cm²h⁻¹)比MO低，这可能是由于其整体带负电荷，大小几乎是MO的3倍。根据释放指数(n)表示药物释放机制的Korsmeyer-Peppas方程，结合前60%的释放数据评估药物释放机制。在这个区域，初始高通量被排除在n的测定之外。图3显示在体外pva -硼酸半固体中PS的通量在体外变异链球菌生物膜。结果显示，在所有配方中，初始区域(一小时)的高通量。

为了保持一致性，在确定释放指数时，不考虑配方中PS释放的第一个小时。在释放指数为0.5、0.51.0的外用制剂中观察到的药物转运机制分别被解释为Fickian扩散、非Fickian扩散、case II转运和Super-case II转运。结果表2，显示了各配方对PS释放的释放指数值及其可能的输运机制。pva -硼酸半固体中MB、TB和RB的释放被解释为超case II输运，而MO的释放则通过非fickian扩散。此外，pva -硼酸半固体中MB和TB的释放变异链球菌生物膜的释放可以解释为非菲克扩散，而RB和MO的释放则是通过菲克扩散。

表2。光敏剂在pva -硼酸半固体中缓释的korsmemeyer - peppas释放参数及溶质释放机理

的影响在体外变异链球菌生物膜和药物传递载体对不同光敏剂的渗透系数的影响图3．结果表明，在空白网格和空白网格的存在下，光敏剂的渗透系数无统计学差异在体外变异链球菌biofilm-coated网。然而，在没有生物膜的情况下，与存在生物膜的情况相比，pva -硼酸半固体释放PS的定量估计值更高在体外变异链球菌生物膜。

讨论

微生物生物膜是在支撑表面上相互粘附的群落，通常由包封的胞外多糖基质屏蔽[13］．这种生物膜将构成有效药物传递的障碍。这与抗微生物化疗尤其相关，其目的是在整个生物膜中达到杀菌浓度，特别是在离药物输送系统最远的地方。因此，生物膜厚度是任何新的治疗方法的重要参数，例如作为光动力抗菌化疗的一部分的光敏剂的输送。为了获得生物膜厚度对扩散的评估，a变异链球菌生物膜生长在惰性但多孔的支撑物上。本研究的结果表明变异链球菌生物膜可在深度为60 μm的合成尼龙网上生长。

在本研究中，我们使用玫瑰孟加拉和甲基橙与吩噻嗪基PS(亚甲基蓝和甲苯胺蓝)进行了比较。MB和TB的有机性质和整体正电荷使它们优于本研究中使用的RB和MO。有机染料具有荧光和光敏特性，已被证明在光照下可有效灭活许多细菌和病毒[14，15]，有机染料的整体正电荷可能促进结合，对细菌有杀灭作用[16］．Soukos等人。[17]表明，阳离子聚l -赖氨酸氯e6共轭物所携带的电荷是导致牙龈卟啉单胞菌和粘胶假单胞菌纯培养物对该共轭物的吸收增加和明显的光毒性的原因。

一般来说，复杂聚合物输送系统中的扩散行为可根据聚合物类型和渗透剂的相对流动性进行分类[18］．pva -硼酸半固体中MB, TB和RB的释放是通过超case II运输(其中药物的释放比其他松弛过程大得多)，而pva -硼酸半固体中RB和MO的释放存在在体外变异链球菌生物膜是通过菲克扩散(其中渗透剂和聚合物段的释放是相当的)。然而，PVA-硼酸半固体中MO的释放，PVA硼酸半固体中TB和MB的释放在体外变异链球菌生物膜是通过非菲克扩散(渗透剂的扩散速率远小于聚合物成分的扩散速率)。

有效的局部药物治疗需要足够量的药物摄取，在特定的时间内达到最大的治疗反应。本研究的结果表明，在所有情况下，pva -硼酸半固体中PS的累积释放量在6小时内都有所增加，而PS在溶液中的爆发释放量在第一个小时内最为明显(图2一个-二维)．这些结果可能表明，pva -硼酸半固体中PS的累积释放可能在使用后的第一个小时内有效，但PS在溶液和pva -硼酸半固体中的释放曲线表明，存在pva -硼酸半固体时释放速率降低在体外变异链球菌与没有生物膜时PS在溶液中的释放或PS负载的PVA硼酸半固体相比，生物膜。这种现象可以解释为PSs与负电荷之间的光敏剂-聚合物的相互作用聚合物在在体外变异链球菌生物膜细胞表面)。

PS在溶液和pva -硼酸半固体中的释放曲线结果表明，与本研究中使用的其他光敏剂相比，甲基橙具有爆发性释放。与RB和MO相比，MB和TB的累积释放百分比相对较低，这表明MB和TB负载的pva -硼酸半固体的释放是通过静电吸引力保持在一起的，这支持了在各种输送系统中配方的类似PS的其他发现[19，20.］．例如，Serizawa等人。20.]利用紫外-可见光谱技术研究了Chromotrope 2R和Indoine Blue染料从聚丙烯胺盐酸薄膜中的释放特性，表明Chromotrope 2R和Indoine Blue染料从薄膜中的装载和释放取决于薄膜中酸碱官能团与染料之间的吸引和排斥静电力。因此，带负电荷的pva -硼酸半固体与带正电荷的MB和TB之间的静电吸引力，最终导致PS释放总量减弱。相反，带负电荷的pva -硼酸半固体与带负电荷的RB之间的斥力导致随后的爆发释放。与带正电的亚甲基蓝相比，甲基橙的扩散系数较高，这可能是由于甲基橙的总体中性电荷，尽管它们的分子量相对相似。亚甲基蓝和甲苯胺蓝总电荷为正电;它们也有相似的分子量值，这都解释了它们相似的有效扩散系数值。玫瑰孟加拉具有整体负电荷，几乎是甲基橙的三倍大。这两个因素可能导致RB的扩散系数略低于MO。

重要的是要了解拟议药物的通量率和渗透系数从输送系统，以确保治疗剂量的管理为预期的目的。图4结果表明，所使用的四种光敏剂均具有相似的释放量，且释放量呈快速稳定下降趋势。最初的高通量可归因于最初的爆发效应，已知在短时间内发生，是不可预测的，通常发生在基于凝胶的递送系统中，这是药物迁移到表面所带来的更高表面浓度的结果[21］．持续的通量在大约一小时后达到更稳定的轮廓。系统膨胀和与周围环境形成平衡所产生的影响可能是定向性的。然而，光敏剂在释放谱开始时的大量释放可能被认为是有益的，表明对口腔病变的配方可能有快速作用。为了达到口腔病变的最佳光疗配方，光敏剂的类型和释放速率是重要的。这是因为释放量必须足够高，才能在给药一小时内产生光疗效果。如果光敏剂的类型是决定光治疗活性的唯一控制因素，那么任何PS都将被选择。然而，问题已经与玫瑰孟加拉，例如，Schaap等人。[22]发现在溶液中自由漂浮的光敏剂产生单线态氧的速度比固定的玫瑰孟加拉高100倍，这可能是由于玫瑰孟加拉负载聚合物的扩散问题。另一方面，MO在465 nm处吸收，这远远低于成功光动力学过程的治疗窗口。此外，Zhiyong等。[23]的结果表明，MO作为PS的饱和还没有达到。因此，在选择合适的PS后，必须在光疗(600-900 nm)内的吸收能力、光毒性和药物释放之间进行权衡，使基于吩噻嗪的PS成为进一步研究的备选外用疗法变异链球菌．

确认

作者感谢来自英国阿尔斯特大学就业与学习系(DEL)的财政支持。

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