印度-缅甸生物多样性热点地区刺蝽科的分布、多样性及其系统发育组织

摘要

米佐拉姆邦是印度-缅甸生物多样性热点的重要组成部分，位于印度东北部的最南端。采用直接搜索观察法和机会取样法调查蜻蜓科分布蜻蜓科。其分布依海拔范围而定森林已经建立了类型，并与湿度、降雨量和温度相关。本研究共记录了28种libellulides;这十种中有一种是来自印度东北部地区的新记录。较高的多样性仅限于低海拔的热带湿常绿林。的系统发育利用两个线粒体基因CO1和ND1建立了Libellulids的亲缘关系。采用最大简约法、最大似然法和贝叶斯方法对分子系统发育进行了推断。在分析的18个属中，Trithemis， Neurothemis, Tramea和Orthetrum恢复为单系。核苷酸之间的距离Tramea limbata在波达玛属植物和波达玛属植物之间，basilaris分布最低，分布最高Neurothemis tulliaCO1和ND1基因的组合

关键字

海拔范围，森林类型，线粒体基因，新记录和核苷酸距离

介绍

根据印度蜥目动物名录，有87种蜻蜓科在39属下[1]。Lahiri记录了来自米佐拉姆邦7属的8种Libellulids [2]。米特拉记录了来自米佐拉姆邦的Libellulids属13属18种[3.]。的动物在印度的调查中记录到15属24种蜻蜓科家庭(4]。

蜻蜓科是一个有争议的系统发育的蜥目动物的不同群体之一，这已经在一定程度上通过分子数据集解决了[5，6]。的11个单系分支蜻蜓科暂定为亚科[7]。线粒体基因细胞色素c氧化酶1 (Cytochrome c Oxidase 1, CO1)可以作为所有动物门的全球生物识别系统的核心[8]。蜻蜓NADH脱氢酶氧化酶亚基1 (ND1)序列分析揭示了所有物种种群结构的强种间和种内差异，并已被证明在蜻蜓的不同分类水平上具有很高的信息[9，10]。

米佐拉姆邦位于北纬21°58′和24°35′;经度92°15′和93°29′，面积21081平方公里。公里。米佐拉姆邦是印度-缅甸生物多样性热点的重要组成部分，位于印度东北部的最南端[11]。森林可分为热带湿常绿林、热带半常绿林和山地亚热带林三大类[12]。的遗传的关系蜻蜓科在米佐拉姆邦发现的物种尚不清楚，并对其中的系统发育工作进行了分析蜻蜓科可以为理解分类群之间的关系提供一个框架。

因此，本研究旨在了解植物的多样性和分布格局蜻蜓科并利用线粒体基因标记CO1和ND1研究Libellulids之间的系统发育关系。

材料与方法

样品收集

利用机会性取样，目测观察目标种或类群[13]。所有标本都是在弗雷泽、普拉萨德和萨勃拉曼尼亚提供的鉴定钥匙的帮助下进行鉴定的[14，15]。

多样性和分布研究

研究区海拔高度分为4类:<100 m;100 - 500;500 - 1000;在印度东北部米佐拉姆邦海拔1000米[图1）.在2010年至2012年的调查期间，我们统计了采样区和保护区的物种数量Libellulids根据其在不同海拔范围内的丰度进行分类。根据所有采样点收集的数据，得出了每个物种在所有四个海拔范围内的分布情况。计算Shannon和Simpson多样性指数作为每个海拔范围内多样性的度量。伯格-帕克优势也被评估为每个高度范围。数据分析采用Biodiversity Pro软件[16]。

在海拔100 m以下的热带湿常绿林中取样。在热带半常绿森林中，海拔高度在100 ~ 1000 m之间，海拔高度在1000 m以上的地区被限制在山地亚热带森林中。在调查期间(2010 - 2012年)，记录了各林型的月平均降雨量、温度和湿度。的多样性蜻蜓科在三种森林类型中发现的多样性指数也相同。蜻蜓的多样性与调查期间的温度、湿度、降雨量有显著的统计学相关性。

DNA提取及序列分析

总计基因组使用修改后的方案提取所有个体的DNA [17]。COI和ND1基因使用先前报道的引物序列扩增[8，10]。用终体积为25 μl的PCR扩增线粒体基因。PCR反应混合物含有1X扩增缓冲液，2.5 mM MgCl₂0.25 mM dNTP，每个引物0.2 pM, 0.8 BSA和0.5 U Taq DNA聚合酶。扩增的PCR热周期为95°C下5分钟，随后是30个循环，分别为95°C下30秒，43°- 58°C下40秒，72°C下30秒，72°C下最终延长6分钟。

PCR产物采用Sanger 's双脱氧法(GCC Biotech, Kolkata)测序。使用BLAST检查所有序列的污染情况。使用成对序列比对(EMBOSS-water, EBI)和FinchTV版本1.4.0对序列进行比对和检查，然后进行手动调整。将所有蛋白质编码序列翻译成氨基酸并检查其ORF [Sequence Manipulation Suite (Bioinformatics.org)和ORF Finder (NCBI)] [18]。

系统发育分析

使用MEGA version 6进行系统发育和分子进化分析[19]。利用MEGA6程序中实现的ClustalW对每个物种的CO1和ND1序列进行组合和比对[19]。采用最大似然(ML)方法，利用核苷酸距离(p-distance)、转换/反转换率比和变异率对不同分类群间的关系进行了评价核苷酸多样性。

采用PAUP*方法，利用启发式搜索选项，采用树分割-重连接(TBR)分支交换，获得了最大简约树(MP)。20.]。启动复制的数量设置为100。通过逐步加法得到起始树，在逐步加法过程中每一步持有的树数等于1。最陡下降选项无效，初始MaxTrees设置为100，其中间隙被视为缺失数据。所有字符的权重相等，零长度的分支被折叠成多截。将多状态分类群解释为不确定性，不强制执行拓扑约束，保存生成的50%共识树。

最大似然(ML)分析采用RaxML [21]。使用ALTER Alignment Transformation Environment生成用于RaxML分析的phililip文件[22]。对于ML分析，bootstrap设置为100，模型设置为GTR-GAMMAI。

使用MrBayes v3.1.2进行贝叶斯推理[23]。使用MrBayes实现的Metropolis-coupled Markov chain Monte Carlo (MCMC)分析获得进化支的贝叶斯后验概率。树木每100代采样一次，用Tracer v1.5评估烧伤情况[24]。

结果

在本研究期间(2010 - 2012年)，在米佐拉姆邦共发现18属28种Libellulids，其中10种为首次记录(表1）.Shannon H’和Simpson’的研究结果表明，100 m以下海拔高度的多样性最高，分别为1.315和21.474,100 ~ 500 m海拔高度的多样性略高于500 ~ 1000 m海拔高度的多样性，分别为1.172和14.895。海拔1000 m以上多样性最小，分别为1.041和11.262。海拔1000 m以上的优势度最高(12.5)，海拔100 ~ 500 m和500 ~ 1000 m的优势度分别为9.375和9.74，海拔100 m以下的优势度最低(8)。表2）.

表1。印度东北部米佐拉姆邦首次记录的分类群名单。

表2。不同海拔带的多样性指数和Berger-Parker优势度。

在海拔100 m以下的热带湿常绿林中，物种多样性最高(香农为1.32，辛普森为21.47)，平均湿度最高(78.18%)，平均温度最高(23.59°C)。调查期间，海拔100 ~ 1000 m的热带半常绿林内平均降雨量最高，为337.42 mm，平均气温为22.56℃，平均湿度为75.41%，Shannon和Simpson的多样性分别为1.19和14.64。海拔1000 m以上的山地亚热带森林物种多样性最低(香农为1.04，辛普森为11.26)，平均气温最低(20.64℃)，平均湿度最低(70.12%)。调查期间，热带湿常绿森林的平均降雨量为238.81毫米，山地亚热带森林的平均降雨量为228.76毫米(表3）.物种丰富度与温度和湿度的相关性有统计学意义，而与降雨量的相关性不显著。

表3。2010-2012年三种林型的多样性指数和物理因子。

利用MEGA6分析CO1和ND1数据

CO1引物扩增出CO1基因线粒体基因组约750 bp长的片段Libellulids在本研究中确定。ND1引物扩增出约580 bp长的线粒体基因组片段，其中包括16S rRNA片段、中间tRNA leu区域和ND1基因区域。本研究生成的序列已提交到GenBank (表4）.

表4。本研究提供的凭证名称和GenBank登录号。

利用CO1和ND1数据对米佐拉姆28种Libellulids进行了遗传距离分析。山竹和龙葵之间的核苷酸最大距离(p-distance)最小，为0.07;山竹和龙葵之间的核苷酸最大距离(p-distance)最大，为0.32 (表5）.

表5所示。米佐拉姆Libellulids的ND1遗传距离(p-distance)。

估计的过渡/翻转偏差(R)为1.005。在一般时间可逆模型(+G)下估计取代模式和速率。使用离散Gamma分布来模拟不同位点之间的进化速率差异(5个类别，[+G]，参数= 0.2603)。A/G = 13.7, T/C = 22.29, C/T = 8.65, G/A = 8.66之间的过渡替代矩阵的最大复合似然估计。核苷酸频率分别为27.72% (A)、39.45% (T)、15.30% (C)和17.53% (G)，包含1个密码子位置^圣, 2^nd3^{理查德·道金斯}和非编码。最终数据集中共有947个位置，包含空白和缺失数据的位置被消除。

白莲科植物的系统发育分析

将CO1和ND1组合在一起进行简约分析，共纳入947个性状;不变字符475个，简约信息字符367个。贝叶斯分析的组合基因集被设定在1000万代的结果树。有效样本量为2057.8059,LnL评分为-10988.589。前20%的树木被认为是燃烧阶段并被丢弃。

系统发育分析支持6个主要支系(图2）.进化枝1包含了这三种物质Trithemis包括进化枝2答:brevipennis和p .同类作为姐妹枝;污染芽孢杆菌和tillarga芽孢杆菌为姊妹分支和独立分支d . trivialis。包括进化支3云状蝶，性蝶和b . geminata哪一个形成了姐妹进化枝c . servillia进化支4具有所有的四种正交音，形成了一个姐妹进化支c . lineata。进化支系5有这两个分支，与杂色蕨和黄蕨形成姐妹分支，进化支系6包括这三个分支Neurothemis哪一个形成了姐妹进化枝答:paranorpoides和b . chalybea它们一起形成了一个姐妹分支b . sobrina和t . Platyptera。

讨论

本研究包括28种蜻蜓科占在印度发现的Libellulidae的34%，其中10种是该地区的新记录。较高的多样性仅限于低海拔的热带湿常绿林。物种丰富度与温度和湿度呈显著相关，而降雨量对物种丰富度影响不显著。

的分布蜻蜓科分布广泛，有超过1000个物种，并试图组织蜻蜓科根据分子和形态特征分为亚科。在CO1和ND1的组合基因中，AT中C/T之间的过渡取代矩阵最高，核苷酸频率高，这是节肢动物的典型特征[25]。结果表明，山梨和山梨之间的核苷酸最大距离(p-distance)最小，而山梨和山梨之间的核苷酸最大距离(p-distance)最大Neurothemis tullia。

在米佐拉姆邦的18个属中，有6个属有一个以上的种。以3种为代表的Neurothemis和2种为代表的Tramea在一个分支中被恢复，具有较高的自举值。Trithemis在贝叶斯分析中，在一个分支中恢复了3种，但其分布状况t . pallidinervis由于最大似然分析和最大简约分析的支持值较低，因此尚无定论。的Orthetrum以4个物种为代表，也恢复为单系，但自举值为欧萨比娜ML和MP分析低c . lineata包含在具有低引导值的分支中。的Brachydiplax以两个物种为代表，在任何分析中都没有恢复为单系，而是保持在一个组中。在贝叶斯分析中，以两种为代表的双翅虫被恢复为单系。在Carle等人认定的Libellulidae 11个亚科的分析中，a.p anorpoids和B. chalybea似乎形成了密切的关系，具有很好的支持价值，本研究纳入了9个亚科。以Brachythemis和Tholymis为代表的Zyxommatinae在一个分支中;Palpopleurinae以6个属为代表，分为两组，其中一组含有双翅目，长尾目，长尾目和Crocothemis，另一组含有Neurothemis和Acisoma。以北曲属(Orthetrum)和克拉蒂拉属(Cratilla)为代表的利贝勒属(Libellulinae)仍在一组Potamarcha属于不同的分支。以Trithemis和Pantala并没有在一个分支中被发现[7，26]。

结论

本研究揭示了该物种的多样性和分布格局蜻蜓科该地区的系统发育分析可能有助于该科的分类蜻蜓科这为我们更好地理解线粒体基因的多样性提供了线索。

致谢

作者感谢印度新德里生物技术部通过生物信息学基础设施项目(No. 5)提供的援助。BT / BI / 12/060/2012 (NERBIF-MUA)。我们感谢社会正义与赋权部和部落事务部资助教资会的拉吉夫·甘地SC/ST国家奖学金计划[F-14-265(ST)/2007(SA-III)， 2007年3月]。作者感谢班加罗尔IIsc的Praveen Karanth的系统发育分析。

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