营养物影响水生物种的生态毒理学反应吗?酿酒酵母和三角棕掌菌的初步研究结果

摘要

本研究对营养负荷和毒物暴露对两种单细胞水生物种细胞生长的影响进行了初步评估，比较了通过对藻类物种(Phaeodactylum tricornutum)和酵母进行的标准化测试获得的结果，使用了最近的生态毒理学兴趣物种(Saccharomyces cerevisiae)。所获得的结果表明，由于营养负荷对细胞生长在两个物种影响毒性的测试化学品。此外，酵母的反应速度更快，与藻类的结果相当

关键字

生态毒理学试验，藻类，酵母，细胞培养。

简介

对海洋和淡水样本的藻类物种的生态毒理学测试已很好地标准化。在欧洲，Microbiotest®购买的是受控的标准批次在体外暴露于不同的藻类种类以及Phaeodactylum tricornutum(海水)及Selenastrum capricornutum(淡水)。UNI EN ISO 10253(2006)是国际公认的单细胞藻类的协议，它评估了暴露于有毒物质72小时后的生长速率抑制。最近的文献证据，如UNI EN ISO 10253(2006)，由于标准化方案相对容易执行和良好的可重复性，现在已常规执行以评估水质(OECD, 2000) [1，2，3.］．单细胞藻类被认为是合适的目标物种，因为它们具有广泛的生物学、生态学和生态毒理学知识[4-7］．尽管对藻类进行试验具有优势，但最近Rumlova和Dolezalova提出，酵母酿酒酵母可能是进行生态毒理学试验的合适物种，因为有机会进行更快速和信息更丰富的生长抑制试验[7］．此外，酵母可在其静态形式和试验酿酒酵母不需要照顾被测试生物的繁殖阶段，减少时间和空间消耗程序。

本文的目的是在初步的基础上评价的适用性酿酒酵母作为生态毒理学试验的模型种，将对该物种的结果与对水生单细胞藻类进行的标准试验进行比较(p . tricornutum)．此外，本研究还评估了营养负荷对两个物种的细胞生长抑制和暴露于化学稀释后的毒理学反应的影响。

材料与方法

实验原理

测试了两种不同的单细胞水生物种:酵母(酿酒酵母)与藻类(p . tricornutum)．对于第一个物种，应用了基于文献的曝光协议，另一方面，对于第二个物种，遵循了标准化的UNI EN ISO 10253(2006)程序。实验集中在两个步骤:i)与暴露于营养梯度后诱导的效应相关的物种之间的比较。将细胞培养物暴露于纯量稀释(1.0 M - 0.01 M)的蔗糖(C₁₂H₂₂O₁₁酵母和正磷酸盐(PO₄^{2 -})以藻类为例;ii)将1.0 M营养物质浓度暴露于重铬酸钾(K₂Cr₂O₇) [8］．

细胞培养和讲座

根据Rumlova和Dolezalova的报告对酵母进行细胞培养，根据AlgalToxkit®的报告对藻类进行细胞培养[8］．所有培养均为无菌无菌培养，实验重复3次(n=3)。酵母方面，即食脱水面包酵母(酿酒酵母汉森)被使用。大约0.1克酵母悬浮在10毫升稀释的物质溶液中进行测试。在30°C下进行有氧培养，并在5.5- 5.6单位内监测培养基的pH值。制备了不含任何毒物或营养物质的水酵母悬浮液作为对照样品。分别在暴露5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和60分钟后估算细胞密度。至于藻类，品种从Ecotox®购买，并按照Renzi等人的报告，根据UNI EN ISO 10253标准化方法进行细胞培养[7］．在初次暴露后的0、24、48和72小时后测量细胞密度。细胞计数由Burker 's chamber标准化讲座进行10次独立重复，每个样品100 μL。没有应用分光光度法技术，以避免由于着色溶液在与藻类细胞计数相适应的波长所报告的影响而造成的误差[7］．

生长抑制计算

细胞生长抑制率(I%)计算为对照生长曲线下的面积(Ac)与每种测试物质浓度下的生长曲线下的面积(Ai)之差，公式如下:I% = (Ac-Ai)/Ac *100。在图中，暴露时间以对数刻度表示(X轴)，而抑制作用则表示为- I% /100。与对照组相比，负值表示被测样品中发生了抑制，而正值表示被测样品中与对照组相比发生了细胞生长刺激。

结果

营养负荷对细胞培养的影响已在(图1)(酵母)及(图2)(藻类)。生长抑制被报道为测试的纯量稀释蔗糖(酵母)或正磷酸盐浓度(藻类)，并表示为测试和对照的生长抑制百分比之间的比率。对于酵母，与对照相比，高于0.10 M的蔗糖剂量刺激了种群的增长，即使在60分钟后，生长速度与0.50 M的对照相当。相反，从0.1 M开始的营养负荷刺激了藻类物种，对于两个考虑的物种，1 M的营养负荷能够显著刺激细胞生长，直到实验结束(酵母和藻类分别为60分钟和72小时)。

在(图3而且图4)分别报道了暴露于不同毒性稀释剂(K₂Cr₂O₇)，当营养物负荷固定在1.0 M时，对所有稀释的毒物。在1.0 M营养物质的存在下，两种物种在较高剂量的毒物下表现出抑制作用。将毒物n. 4曲线与营养物曲线进行比较，酵母在最低测试剂量下也表现出显著的反应，而藻类在最低稀释测试时没有表现出毒性。

讨论

由于广泛的人类活动所排放的废水，营养负荷对淡水和海洋生态系统均产生重大影响[9，10］．水生生态系统中营养物质对藻类的富营养化作用已被文献充分记录[11］．此外，营养物质(蔗糖)对酵母代谢途径的影响也是众所周知的[8］．我们的数据证实，暴露在营养物质中对两个物种的细胞生长都有积极的影响。尽管如此，关于营养物质和毒物暴露对标准模型物种(即藻类)和酵母的加性效应的数据很少。初步研究结果表明，营养物质可以引起被试物种的生态毒理学反应发生显著变化。特别是藻类和酵母物种，由于其特定的生态环境，对营养负荷特别敏感。

酿酒酵母在过去的9000年里，它的广泛使用已经成为人类文明的宝贵财富，但它的生态意义呢酿酒酵母同样值得注意的是，它是一种无处不在的物种，可以通过动物，特别是黄蜂传播[12］．此外,酿酒酵母在淡水生境中进行生态毒理学试验是一种有用的种，因为它的培养成本低，易于进行和管理在体外实验。此外，酵母的生物学和遗传特征是众所周知的，并被广泛记录，酵母是遗传研究的合适模式物种。尽管如此，这个物种在生态毒理学试验的文献中很少有代表。所获得的生态毒理学结果应仅被认为是酵母种的初步结果，因为需要进一步标准化所使用的方法在体外实验。尽管如此，该物种证明了有趣的反应，可以代表一个有用的和有趣的试验物种的生态毒理学目的。结果表明，营养负荷对单细胞水生物种的反应有显著影响。因此，使用被测试物种对复杂的环境水生基质以及出水或沉积物洗脱物进行急性生态毒理学测试时，应与被测试水样中的营养定量密切相关，以在一定程度上考虑这种对生态毒理学结果的"营养效应"。本研究获得的初步结果还表明，在酵母试验中暴露60分钟及以上可能有助于突出毒物暴露的慢性影响。即使需要进一步的研究来更好地阐明生态毒理学反应，获得的结果是令人鼓舞的，并表明酵母是有趣的模式物种。

结论

酿酒酵母代表一个有趣的物种生态毒理学的目的。此外，与藻类(3天)相比，在较短的时间(60分钟)后，可以检测到细胞生长的明显抑制。尽管如此，测试方法需要标准化。结果表明，急性生态毒理学测试可能会受到测试水样中营养素的影响，这些营养素会对细胞生长速率产生显著干扰。

致谢

作者非常感谢生物科学研究中心和Poliservizi工程对实验室活动的支持。

参考文献

1. UNI EN ISO 10253:水质-海藻生长抑制试验Skeletonemacostatum而且Phaeodactylumtricornutum2006．
2. 经济合作与发展组织(OECD)．困难物质和混合物的水生毒性测试指导文件。环境健康和安全出版物测试和评估系列，第23号。2000年，法国巴黎。
3. Moreira Santos M，等。用于常规原位环境评估的浮游植物生长试验。环境毒理学与化学。2004;23:1549-1560。
4. 环境变化在模型硅藻中引起形态相互转换的生理和分子证据Phaeodactylumtricornutum.Protist.2011; 162:462 - 481。
5. 弗兰西斯G等。纳米结构与纳米力学Phaeodactylumtricornutum形态类型。环境科学。2008;10:1344-1356。
6. Falasco E，等。硅藻畸形形态与环境变化综述。Hydrobiologia。2009;623:1-35。
7. Renzi M，等。基于生态毒性评价的预警工具Phaeodactylumtricornutum．生态毒理学。2014;23:1055 - 1072。
8. Rumlova L和Dolezalova J.利用酵母的一种新的生物试验酿酒酵母用于水中有毒物质的快速检测。环境毒理学与药理学。2012;33:459-464。
9. 王毅，等。人类活动影响下黄海北部四十里湾营养物质时空分布海洋污染通报，2012;64:2708-2719。
10. Alomar C，等。双壳类稳定同位素信号的评估耳廓nobilis在不同的人类压力下。海洋生态学报，2015;29(4):344 - 344。
11. 张杰，等。海草的生理反应Thalassia hemprichii(Ehrenb)。ascher作为营养负荷的指标。海洋污染通报，2014;83:508-515。
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