研究与评论在药学和制药雷竞技苹果下载科学
菜单e-ISSN: 2320 - 1215 p-ISSN: 2322 - 0112
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米凯拉塔玛拉康;卡洛琳Casagrande Sipoli;Lucimara Gaziola De La Torre*
材料与化学工程学院攻读生物工程,坎皮纳斯大学(由),巴西
收到日期:15/12/2015;接受日期:21/12/2015;发表日期:28/12/2015
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如今,许多研究人员在基因传递的重点是开发方法生产纳米粒子可再生的物理化学特征,连续和可伸缩的过程不需要后加工步骤。另一个关键因素是转置条件从体内体外基因传递到细胞和组织。在这种背景下,微流体技术正在取代传统的方法来产生纳米粒子,把核酸融入他们,体外转染细胞。在微流体,凸显了droplet-based系统所提供的一些特殊参数picoliter隔间创建使用两个水火不相容的。几个微/纳米颗粒用于基因传递可以通过dropletbased生产系统较低的多分散性指数,如脂质体、生物/聚合物纳米粒子、金属纳米粒子,,多聚体微凝胶。在体外转染,众所周知,传统过程井导致细胞的扩散微/纳米粒子传输,然而在液滴微流控平台也有对流的贡献,促进和提高了转染的控制。此外,水凝胶滴可以为细胞提供一个3 d环境类似的组织生活,实现体外更类似于体内细胞的行为。因此,本文的目的是在微流控液滴系统总结新趋势发展到基因传递的研究,因为微/纳米颗粒生产体外转染。本文为未来的挑战带来新的见解和理论原则表明,我们可以开发健壮的微流体系统基因传递的研究
基因传递,Droplet-based微流控,病毒性向量,核酸,转染。
微流体技术,利用在许多地区,与强调细胞生物学(1]。无数的优点,比如使用少量的样本和反应物,最小设备大小,控制质量和传热,层流,低成本和功耗和低成本的设备生产2,3]。生产领域的纳米颗粒基因传递,许多正在努力为了开发可扩展的和可再生的物理化学过程特征(平均直径,电动电势和多分散性指数)(4]。在这种背景下,微流体似乎像一个强大的战略连续,可再生的,可伸缩的微型和纳米粒子高度单分散的生产(5]。此外,微流控液滴平台可以提供一种封装效率高,因为它允许纳米粒子的自组装过程形成和活性物插入只有一步,使用低量的试剂(6]。
除了比纳米颗粒生产,droplet-based微流控系统也可以用于转染细胞在体外。最常见的是使用物理方法,如电穿孔和显微镜下注射,或化学方法通过使用脂质和聚合物纳米粒子7]。自从微流体产生非常均匀的液滴,它们适合单细胞或封装在体外单个基因的表达(8]。分子由细胞分泌的快速检测由于低容量周围的每一个细胞,转染的允许调查参数在实时文化9,10]。微流体还可以提供一个三维(3 d)环境使用水凝胶滴时,这是非常重要的附件细胞培养和增殖11]。微环境更相似在活的有机体内打开转染领域的新方法,如机械刺激(刚度矩阵)如何增加内化的途径以促进病毒性载体插入细胞内,因此,提高转染效率(12]。
综述,提出当前微工程的最先进的微/纳米颗粒的合成方法和细胞转染方法droplet-based微流体平台。首先我们现在概述关于基因治疗和病毒性载体的作用在这种背景下,我们提出一些技术后产生微/纳米颗粒在微流控液滴系统也考虑关键因素产生可控的和稳定的液滴,最后我们展示的转染方法内液滴与常规转染井进行比较。
基因治疗是指遗传物质转移编码治疗感兴趣的基因进入细胞,组织,或整个器官与顺向转基因的表达来治疗疾病。然而,对于基因治疗的成功,复杂的和高效的交付系统的开发能够转移基因是一个关键因素13,14]。简而言之,我们可以描述两类高效核酸载体:病毒和病毒性向量;能够防止核酸降解,细胞内交付和一个相对安全15]。在十年前,患者immunodeficiency-X1,块T和NK淋巴细胞分化、治疗与基因治疗试验和x染色体相关重度联合免疫缺陷症(SCID-X1)基于使用cDNA逆转录病毒(16,17]。之后,法国病人的T细胞白血病治疗的逆转录病毒载体整合LMO2附近原癌基因启动子,生产异常转录和表达LMO2 [18]。这些事实导致乐观的基因治疗研究。如今,基因治疗临床试验出现在世界各地,主要是在美国(62.6%),英国(10.3%)和德国(4.1%)和通常用于治疗癌症(63.8%)、单基因疾病(8.9%)和传染病[8.2%][19]。最常见的向量用于基因治疗仍然是病毒载体,突出腺病毒(22.5%)和逆转录病毒(18.8%),而且脂质转染(5.2%)和裸pDNA(17.5%)提高使用(19]。尽管病毒载体代表向量用于基因治疗的大多数由于其高效转染,他们可以调用免疫反应或protooncogene激活。在这种背景下,病毒性向量有承诺和未来,考虑他们的再现性和安全使用的20.]。
阳离子脂质体是病毒性向量主要由阳离子脂质保证他们积极的表面电荷,以静电相互作用与带负电荷的核酸,直到形成复合物仍积极液体电荷(21]。因此,这些积极的复合物进入细胞内,其表面膜带负电荷(22]。一旦进入细胞,复合物释放核酸在细胞溶质,RNA,快速合成的靶蛋白,重要的是要实现快速响应与疾病像癌症23];或细胞核的DNA,控制基因表达长期(21]。Felgner [22)发展的先锋的阳离子脂质体核酸交付由1:1的比例DOTMA [N - [1 - (2, 3-dioleyloxy)丙基)- N, N, N-trimethylammonium氯)和涂料(dioleoyl-l-α-phosphatidylethanolamine),当时Lipofectin商业化。例如,使用阳离子脂质体在体外有效载体丙型肝炎病毒蛋白质在人类肝细胞细胞系[HUH7] [24),在活的有机体内交付linamarase基因治疗脑部肿瘤的动物或人类[25]。最近,其他商业阳离子脂质体被用于基因治疗,由于他们的协议的;提供高转染效率在某些特定的细胞和一些特定的核酸,如Lipofectamine DMRIE-C, Oligofectamine, Ambion, 293 fectin Optifecta, Invivofectamine, FuGENE, TransFast、转染和CLONfectin。我们的研究小组(26)也显示的可行性dehydrated-rehydrated EPC(蛋磷脂酰胆碱)组成的脂质体DOTAP [1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium丙烷],涂料(分别50/25/25% mol / l)携带分布编码HSP65,结核病的预防和治疗。最近,我们获得相同的阳离子脂质体在大规模生产乙醇注入法核酸交付到树突细胞作为一个潜在的工具对癌症免疫疗法(27]。此外,其他结构的纳米粒子组成的脂质,如固体脂质纳米粒,也可用于基因传递。例如,德尔Pozo-Rodriguez [28]显示冻干固体脂质纳米粒作为交付pDNA稳定结构编码绿色荧光蛋白在HEK293细胞文化。鲁道夫(29日]显示固体脂质纳米颗粒应用于交付二聚的hiv - 1乙肽进入支气管上皮细胞在体外和应用小鼠的肺在活的有机体内。
除了阳离子脂质,阳离子聚合物,如壳聚糖,形式也有效的配合物与核酸(30.]。壳聚糖,共聚物组成的D-glucosamine N-acetyl-D-glucosamine残留,是一种独特的聚(aminosaccharide)通过化学具有几丁质(31日,32]。反过来,甲壳素是软体动物的结构组件33),节肢动物(34)喜欢昆虫35和甲壳类动物36),线虫(35和真菌的细胞壁37),酵母和菌丝38]。壳聚糖在pH值低于6.5,酸度系数值,显示脱去乙酰基子单元与伯胺组带正电。同样的阳离子脂质体,这些阳离子聚合物与核酸能够链接静电,提供净正电荷polyplexes,允许他们与细胞相互作用[39]。基因载体壳聚糖一直被认为是一个很好的候选人,因为它被认为是一种生物相容性,生物降解,有毒物质和低阳离子高潜力(40]。例如,Dass [41注册一个质粒表达色素epithelium-derived因素为壳聚糖微粒子和结果在体外显示骨肉瘤细胞系的anti-invasion和增加附着力SaOS-2和在活的有机体内这个复杂的确认作为基因治疗骨肉瘤的承诺。另外,壳聚糖的mucoadhesive财产允许持续治疗基因的基因传递通过胃肠粘膜政府,像显示由郑42]使用pDNA编码绿色荧光蛋白(GFP)量化转染效率的粘膜胃、十二指肠、空肠、回肠和大肠。虽然壳聚糖是最常见的多糖用于纳米粒子制造,还有其他生物聚合物纳米颗粒基因传递是否由合成聚乳酸类聚合物和[D, L-lactide-co-glycolide] [43)或由另一个天然聚合物,如白蛋白、明胶、海藻酸、胶原蛋白、蚕丝蛋白(44]。
此外,金属纳米粒子也显示作为基因传递好潜在的候选人,因为它们可以功能化与核酸(共价或非共价结合45]。麦金托什et al。46]显示携带tetraalkylammonium配体的金纳米粒子静电相互作用与DNA共价债券,为了抑制转录的T7 RNA聚合酶在体外。另一方面,Oishi [47),由共价键固定在聚乙二醇金纳米粒子核含有巯基共同形成SH-siRNA绑定,当应用在体外、增强基因沉默在HuH-7细胞活动。此外,半导体纳米粒子,如碳纳米管、量子点和磁性纳米颗粒,可以修改作为人们在基因传递。例如,单壁碳纳米管功能化lipopolymers允许siRNA链接,这样它就可以被交付在人类细胞减少或沉默HIV-specific细胞表面受体的表达。同样,DNA可以自发地封装成碳纳米管通过范德墙壁或hydrofobic部队暴露在水溶质环境(48),或者携带铵的衍生品,核酸可以用碳纳米管静电相互作用[49]。邱(50]介绍了量子点携带氨基酸组或链霉亲和素与线性共轭核酸盒式分子在植物治疗或预防疾病。此外,神灵et al。51)演示了使用磁性纳米粒子表面改性的可行性来自铁氧化物,如磁铁矿(Fe3O4(γ-Fe)和磁赤铁矿2O3),基因传递。基本上,magnetofection机制[转染磁性纳米颗粒)类似于使用油脂的纳米粒子,然而添加磁性纳米颗粒/核酸复合物之后细胞培养基,是磁力的方法配合物应用于细胞表面,从而实现更高的转染效率(51]。然而,同样重要的是纳米颗粒作为病毒性载体在基因传递领域,纳米粒子的方法生产,为了保证其再现性和无毒害在体外和在活的有机体内应用程序。在这种背景下,微流控液滴系统出现一个充满希望的自下而上的方法来生产这些纳米颗粒。
微流体的一般概念是在少量的反应物在微通道的操作控制和操纵能力的分子在空间和时间52]。在微流体可以使用少量的反应物,反应的周期很短,可以使用并行操作(53),大的表面体积比和化合物的扩散和传热快(54]。优点可以在微流体设备相关流层流和对应于一个低雷诺数(52,55),结果两个流动之间的混合流发生的主要扩散(53]。微流控的起源是在90年´s微电子机械系统(MEMS)领域(54]。如今微流体被利用在许多领域都是:
生物分析——检测生物分子(56,57),操纵和放大58)和DNA分离毛细管电泳(59]。
纳米颗粒的生产,聚合物粒子(62年,63年)、脂质体和脂质囊泡(64年- - - - - -66年),金属纳米粒子(67年]。
交付/基因转染电穿孔(68年),水动力和光学能量(69年]。
不同的材料可以用于微通道的建设和生物应用玻璃和聚合物分离(70年]。玻璃被认为是生物相容性,不透水气体(70年,71年),有物理和化学稳定性,它是亲水(70年]。准备微器件的技术在玻璃激光烧蚀和湿蚀刻(70年]。微器件也可以由聚合物不贵,有可能改变化学配方(71年,是稳定的52和疏水70年]。已经广泛使用的弹性体作为建设是聚(二甲基syloxane)著名的PDMS,而且采用的技术是软光刻技术(72年]。
此外,重要的是要考虑相关的润湿性和液滴系统微孔道材料。由于连续相浸湿墙壁比分散相液滴之间形成一种薄膜和墙73年]。液滴破裂发生在连续相弄湿设备墙而不是分散阶段,因此液滴形态是物质之间的相互作用的结果,形成设备和连续相(73年]。
总结疏水通道需要准备水在油系统、反向亲水通道形成所必需的油在水乳剂(74年]。考虑使用PDMS设备建设的优点,在文献中报告不同的策略来改变材料的润湿性,通过化学修饰74年,75年]。
操作中使用的两个主要原则微流控系统中的水动力流聚焦和液滴的方法。一些优势滴过程可以被描述在比较与层流流程。层流,溶质都分布在溶剂,化学反应的效率和检测的一些分子内部的渠道可以降低,这种现象叫做Taylor-Aris色散(76年,77年]。滴过程的使用也减少了接触固体墙壁的概率减少试剂吸附到通道墙壁(雷竞技网页版77年]。水滴里面有样品可以被视为微反应,允许小卷的操作(15,78年]。此外,在液滴微流体可以执行许多反应不增加数量和通道的大小(13]。此外,在微尺度范围内,考虑到表面积和体积之间的关系,反应更快,因为传热传质次,还扩散距离短(3,13]。使用分段流在不同反应物分离picoliter /只滴一直在使用情况下小型系统必须实现[79年]。分段流乳剂是一种亚稳胶体系统的原则(80年)有两个水火不相容的。在这种情况下有一个连续相,分散相液滴格式(73年,79年]。
为了形成稳定的液滴,表面活性剂的使用是很重要的。表面活性剂被称为两亲性分子与不同团体和有亲和力不同阶段非混相。由于不同的组织结构,表面活性剂分子去界面和结果阶段之间的表面张力降低(81年]。将液滴作为微反应器的必要条件是避免它们的聚结。因此,表面活性剂除了提供稳定的亚稳状态(80年,81年]。
此外选择表面活性剂是规则的成功稳定的液滴和生物应用程序有适当的分子生物相容性系统(81年]。氟化油有望成为应用在生物技术领域;然而一些表面活性剂可以稳定水油界面乳剂(81年]。不同的分子正在研究和发展微流体的应用程序。如今,嵌段共聚物perfluoropolyether和polyethylenoxide最有趣的分子存在。众所周知,这些分子减少蛋白质吸附或与细胞膜相互作用[81年]。
另一个重要的分子是triblock共聚物表面活性剂由perfluoropolyether (PFPE)和聚乙二醇(PEG)块82年]。然而问题是表面活性剂改性的局限性可以通过不同分子量或链端功能化。这样,瓦格纳等提出了合成和表征polyglycerol-based triblock表面活性剂,和例证droplet-based微流体细胞封装的应用程序在体外基因表达研究[82年]。这些水滴的一致性和小体积允许他们被用于定量分析要求减少了试剂的量,因此,提供一个低成本技术(2]。此外,水滴隔间设计可以提供综合信息分子功能活动或抑制功能,分子身份并评估分子执行其功能通过测量的能力,例如,一个荧光产品。此外,液滴在微流体平台给可能几个单元操作设备,像水滴可分为,融合,孵化,分析,排序和分解83年]。混合液滴技术提供了更好的使用效率和控制反应物浓度(3]。
使用两个不同的类别以达到高效的混合和液滴生成:被动和主动方法(13,15,30.]。被动的方法是基于微通道几何和/或液体流量(70年]。被动的方法可分为类别根据类型的几何图形用于促进液滴的形成。主要类型有:Co-flowing、错流和拉伸流(73年]。
另一方面,积极的方法依赖于外部能源的使用,完成所需的混合物(30.]。外部的能量可以电场84年],声学流体晃动[85年),超声振动等。使用微流控液滴颗粒生产技术仍然是一个挑战的规模自作品在文献中报道微粒子和纳米粒子稀缺的报告。液滴的大小几至几百微米的多数作品统一和连续流和多分散性可以非常小(73年]。
一个比较传统的方法可以以可视化与微流控液滴技术的区别。滴一个原则生产聚合物粒子的方法制备的水在油相液滴的凝固,然后通过添加交联剂液滴发生根据图1,这种方法称为乳液交联,它已被广泛用于制备壳聚糖微粒子(86年]。
图1:示意图配置聚合物粒子的传统方法生产的。
在微流控方法方法是微型和纳米颗粒的生产渠道内发生在连续模式。一个简单的方案中描述图2和系统的配置可以根据粒子的性质发生了变化。在某些情况下,交联剂的加入在第二个地区入口后,液滴的形成(87年]。
图2:微流控方法的原理配置聚合物粒子的生产。
不同的方法来产生纳米粒子基于液滴技术正在研究。在此,我们将总结一些方法。基本上产生不同的粒子的主要一步液滴技术是基于单一的乳液或双乳液的生产。下面的步骤是继承类型的意图产生的粒子。例如,单分散的可生物降解dextran-hydroxyethyl丙烯酸甲酯[Dex-HEMA]微凝胶在内联通道几何液滴的过程。这些微粒子通常用于控制着蛋白质的交付。连续相是矿物油和水相Dex-HEMA水溶液(30% w / w)。然后,作者使用了非离子表面活性剂,它被添加到油相浓度的4% (v / v)。水滴形成当压力被应用于反应物水库。不像,增加水库Dex-HEMA液滴的速度生产的压力也增加了(32]。水滴前准备包含dex-HEMA的水溶液也添加了一个photoinitiatior为了聚合水滴离开设备时,还在石油通过紫外线照射。为了独立,从水相油,进行了离心后用去离子水清洗步骤。准备意味着平均直径的敏捷- - -单分散的微凝胶是D = 9.9μmμm±0.3。(32]。
另外,挂39)提出了两种不同的技术来生产聚[lactide-co-glycolide] PLGA微/团簇在微流体设备使用液滴的过程。PLGA是合成共聚物形成的羟基乙酸和乳酸,它也是美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗。第一种技术是建立在溶剂蒸发生产PLGA颗粒微尺度。在这种方法中,PLGA溶解在有机溶剂碳酸二甲酯(DMC)。第二步是水滴的生产由于有机溶剂混溶在水里。PDMS微流控设备进行的,那么它是必要的表面处理设备,以支持在水滴的形成石油生成过程。治疗的应用程序内聚(乙烯醇)(PVA)微通道。研究了PLGA浓度从0.5%到5% (w / w)。PVA也用作表面活性剂在水相。德滴生产有机溶剂蒸发后由于高波动性和粒子的形成。 The micro particles sizes are directly proportional to the PLGA concentration varied from 3 to 30 μm approximately. Moreover, the second microfluidic technique studied by the authors was called solvent extraction [39]。对于这种情况PDMS表面设备没有接受PVA,因为液滴生成的原理是水油。的设备是由三个入口:硅油跨度80 [1%],PLGA在二甲亚砜(DMSO) (PLGA wt溶解在1% DMSO)和水。PLGA-DMSO水滴,水滴单独生产,但他们融合序列和DMSO溶液提取到水导致PLGA降水。齐次PLGA纳米球的形成发生和大小约100海里。方法生产生物聚合物水凝胶由张[文献中描述40]。海藻酸的方法被用来准备胶囊,κ-carrageenan和carboxymethilcellulose(这里我们只集中于描述海藻酸胶囊)。水凝胶的生产是在PDMS Y形平面进行设备。分散水相含有海藻酸、交联剂(裁)溶解在连续油相(十一醇)。液滴的形成发生的不混溶性两个反应物和Ca时形成水凝胶2 +从有机溶剂扩散到水相含有海藻酸。流量的增加液滴大小的减少造成的。这种变化可以看出Qaqueous时从0.3改为0.7 mL / h和Q石油从0.2到15毫升/小时,直径范围从230到30嗯。一个有趣的发现是观察海藻酸凝胶发生的液滴的液滴表面改变了。海藻酸盐微凝胶在PBS溶液和5000年稳定粒子/分钟生产在测试装置上。
可以很容易地描述为聚合物囊泡或多聚体是两亲嵌段共聚物的自组装书架(88年,89年]。多聚体产生的一般方法是类似于脂质体生产。疏水基团往往副为了减少与水接触。雷竞技网页版两亲性共聚物水分往往形成囊泡(88年]。为生物医学应用程序通常使用的材料组成了两亲性嵌段共聚物的生物相容性、生物可降解疏水性聚合物(聚脂或polyamino酸)块共价成键可以使亲水性的生物相容性聚合物如聚乙二醇(PEG) (89年]。多聚体不同作者描述微流体技术准备在微尺度范围内。Lorenceau [90年)解释的困难多聚体常规方法获得较低的多分散性,于此,作者开发了一个液滴微流控技术来获得较低的poymersomes从双乳多分散性。保证双乳状液的形成的设备是由2轮毛细管外广场管包装。双乳状液结构就像water-in-oil-in-water和diblock共聚物是保利(normal-butyl丙烯酸酯)聚(丙烯酸)[PBA-PAA]和不同浓度从0.1 wt %。di的有机相嵌段共聚物溶解是一个四氢呋喃(四氢呋喃)和甲苯的混合物浓度从50 - 50 wt % 80 - 20 wt %。双乳状液的形成可以解释为在毛细管内的流动水相(精华水)和有机相同轴相连。外部水相(80 wt %的甘油水混合物)相反的方向流动的管外广场和hydrodinamically聚焦乳液毛细管。然后产生了双重乳液。根据作者形成多聚体的混合有机溶剂蒸发时从中间阶段的双乳液。流率研究表明,液滴生成可以假设两个计划像滴外流速低时使用或喷射外流率高。多聚体的生产证明当量子点粒子被添加到内部水相外,未发现微量荧光粒子的聚合物膜(90年]。类似的微流体之前报道的方法研究是用于生产的多聚体diblock共聚物PEG-b-PLA[聚乳酸][91年]。最近准备使用多聚体diblock共聚物PEG-b-PLA,然而以前的工作之间的差异是,polymersome核心包含海藻酸与钙离子反应通过创建一个渗透压(92年]。
壳聚糖是一种生物高聚物,它已被广泛用于医学领域(93年]。使用的主要原则通过离子凝胶壳聚糖颗粒生产发生相反电荷从壳聚糖胺组之间,从reticulante代理(94年]。在文献中,所述方法为壳聚糖颗粒生产的多数,传统的过程。在微流控过程中使用水动力流聚焦一些研究报告(62年,95年]。液滴微流控系统中,杨87年)壳聚糖微粒含有氨苄青霉素生产硫酸与铜作为交联剂(CuSO4][87年]。材料设备是聚甲基丙烯酸酯(甲基丙烯酸),它是由5层由螺钉4水湾综合[1壳聚糖入口,2注油口,1交联剂进口)和1跨连接通道。连续相由葵花籽油,液滴的形成发生在壳聚糖3% (w / v)与氨苄青霉素16.6% (w / v)在通过cross-junction与油相接触。雷竞技网页版后者与CuSO由离子凝胶化反应产生的水滴4。不同的流量比进行了测试,以验证微球大小的影响。作者发现,保持相同的水相流量和增加石油流量水滴大小降低了。水相流率从0.001毫升/分钟。- 0.1毫升/分钟。和0.1毫升/分钟的连续相。1毫升/分钟。微球大小变化从100年到800年μm改变微通道中的流量设备。用类似的方法,同一组研究壳聚糖微粒生产(96年]。然而,纳米粒子的形成发生在微流控装置,因为壳聚糖包含reticulante剂乳液滴在反应堆钠三磷酸(TPP)。在这种情况下,从180 - 680μm壳聚糖微粒大小不同96年]。
脂质体是由磷脂双分子层囊泡形成。在文献中脂质体的连续方法生产使用微流体通道已经报道(64年,65年]。使用液滴技术准备脂质体仍在微尺度范围巨大的囊泡的形成。Sugiura [97年)使用脂涂覆冰滴水化方法准备4—嗯之间巨大的囊泡三个基本步骤。有机相己烷,3%的wt失水山梨醇油酸酯(80年跨度)和stearylamine作为乳化剂。后乳化O / W成立于疏水通道,水滴从己烷溶液冷冻和随后的分离。温度保持在-10 oC,跨度80与磷脂酰胆碱是通过添加己烷代替,胆固醇和sterylamine 5:5:1的摩尔比率比例。有机溶剂被除去,水被添加到系统保持巨大的囊泡(97年]。
另一种方法来产生脂质囊泡形成的双乳状液(水在油)在连续流关注以便生成液滴大小的小变化(66年]。囊泡的后续步骤是生产的提取溶剂。囊泡的直径在20 - 110之间。脂类的解决方案使用DOPC [1, 2-dioleoylsn - glycero-3-phosphocholine]溶解在油酸。内部水相是水与普朗尼克作为表面活性剂和外部水相是由甘油,普朗尼克、乙醇和水。作者表明,流速变化改变了囊泡的直径。生产使用的设备与控制囊泡直径也有效的生物活性反应物(封装66年]。此外,金和银纳米粒子使用乳液微流控技术可以获得。作为准备与PDMS化学处理的含氟聚合物聚(1 h, h, 2 h, 2 h-perfluorodecyl acrylate-coethylene乙二醇丙烯酸)制成,防止只有油相浸湿频道。巩膜几何就像多个T-injection。之间的配置提升混合金属盐和离子液体还原剂。这是作为连续相氟碳油。溶液入口是:解HAuCl4/1-methylimidazole(第一个入口)和硼氢化1-butyl-3-methylimidazolium也表示BMIMBH4(第三个入口)都溶解在1-butyl-3-methylimidazolium bis (trifluoromethylsulfonyl)酰亚胺[BMIMTf2N]。这两个入口之间纯BMIMTf2N缓冲流注射,以避免两个流之间的扩散(第二个入口)。作者发现最优流量条件被连续相10毫升/ h和分散相的0.5毫升/小时。球形金纳米粒子被发现≈4.28 nm,而且同样的方法被用来准备银纳米粒子与≈3.73 nm (98年]。
纳米/微粒子用作基因传递病毒性向量(99年]。在文献中很少有工作报告病毒性向量之间的络合和核酸使用液滴微流控技术(7,99年]。Picolitre微流体反应堆和孵化器系统(99年)是用于控制lipoplexes阳离子脂质和DNA的形成。使用的油相是矿物油,表面活性剂是失水山梨醇油酸酯为0.4% (v / v)。Lipofectin,用作阳离子脂质,质粒DNA在降低血清培养基分别稀释。之后,介绍了阳离子脂质和DNA在不同的微通道的入口。狭窄的地区两个水阶段满足油相被作者称为夹止点和水滴形成。为了使完整的反应物混合物,水滴进入蛇形通道导致混乱的平流。混乱的平流的特点是反复拉伸和折叠的液体以形成薄液层导致反应物之间的快速扩散,(15]。蜿蜒的地区后,水滴流入self-splitting地区为了液滴分裂,他们收集到一个孵化区域。lipoplexes形成在微流体设备显示的尺寸分布窄如果相比方法准备散装(lipoplexes通过涡流的形成或手摇晃)和转染效率也是一致的99年]。
生产polyplexes之间形成聚合物和DNA被格雷斯比和同事调查(7]。作者比较了polyplexes准备在传统的方式,在微流体设备使用液滴技术。是一个使用的聚合物聚(氨基胺)和质粒DNA或信使RNA是用作核酸。液滴微流控交叉流发生器是使用4水湾:1进口油相包含FC-40氟碳油和2%的聚乙二醇fluorosurfactant 1入口与相应的核酸,入口(核酸和聚合物之间)与缓冲溶液,最后一个进口聚合物。水滴结产生的渠道。建立了流速为7,5 ul /油阶段,2分钟,5 ul /分钟的水阶段。收集液滴破碎的使用正确反应物和polyplexes直接从水上层清液使用。实验的物理化学特性和细胞进行了调查。作者表明,通过微流体技术大小、电动电势和多分散性指数下降如果与体积的方法。此外胶体和绑定的稳定增加,提高转染不同细胞类型(7]。强调复合物的形成是很重要的病毒性载体和酸核之间通过微流控液滴技术还必须广泛调查。
转染,过程介绍核酸进入细胞,用于研究基因和蛋白质功能和监管One hundred.]。因此,通常转染细胞培养系统在孔板插入在活的有机体内(101年,102年]或只进行分析在体外(103年]。简而言之,有三种转染方法:物理、生物和化学,选择根据细胞类型和目的One hundred.]。Physical-mediated方法是由显微镜下注射(104年),即peg粒子交货(105年),电穿孔(106年),光学基因转染(107年],sonoporation [108年和磁性纳米颗粒109年]。生物方法包括那些病毒向量(110年),化学方法包括脂质和聚合物向量(111年,112年和磷酸氢钙113年]。转染方法选择为了转染效率高、安全、再现性、低细胞毒性和应该易于使用(One hundred.]。
虽然,当研究纳米粒子的细胞吸收在体外转染,通常相关的生理刺激流体流动的忽视和内化在静态条件下进行化验。但是,无论是在理论(114年)和实践(115年),它已经表明,流体的机械刺激是一个重要因素来达到最佳的转染效率(116年]。在传统转染方法进行井,只有纳米粒子的扩散运输细胞表面的目标。在微流控系统中,对流贡献可以添加到流程,增加细胞表面和纳米粒子之间的碰撞率,因此,显示更多的可控和容易转染(117年]。
因此,droplet-based可用于微流体设备在体外转染,滴一个定义了一个picoliter隔间,允许单个细胞封装和在体外表达的基因,比传统的方法使用更少的试剂(8]。微流体环境还提供了独特的可能性来模拟动态条件下,打开新的可能性进行调查。所以,流程和技术用于基因传递,如用于物理方法,可以更好地控制和优化微尺度环境(69年]。总而言之,我们做了一个对比表显示差异,传统转染井和微流体系统(表1)。
表1:比较表总结传统转染体外转染的井之间的差异和droplet-based微流体系统。
微流体,更具体地说,内部细胞转染式微通道参数的分析,是当前的主题。因此,在过去的十年中,许多专利涉及这些问题被提出。例如,细胞可以被合并在微流体设备用于处理细胞电穿孔和电熔118年,119年)也可以被测量的信号分别进行了分析和排序optical-detectable分子(120年,121年]。因此,集成这些步骤可以创建一个生物环境类似于在宏观尺度上,但有利的微格式的工程特性。液滴微流体可以提供一个层流行为改善传热传质现象,由于高表面积与体积的比率(10]。此外,droplet-based微流体系统表现出更感性生物标志物发现比单相微流控系统或传统的方法,因为他们放大极低水平的生物标记分子的检测,由于非常低的体积在试剂里面滴抑制其色散(9,122年]。其他droplet-based方法的优点是快速混合试剂的添加一个混乱的平流的质量输运扩散里面滴(55,122年),很少或根本没有区分不同样品之间的交叉污染。划分减少交互的试剂不同滴,让一个简单的并行的独立实验在不增加设备的复杂性或大小,为这些设备提供非常高的吞吐量(15]。
从的角度来看在体外转染,液滴微流控系统可以应用于单个细胞室。最近,一些为了获得发表的专利发明可以封装细胞液滴中一个接一个独立于细胞密度(123年]。或者嵌套标签封装细胞矩阵,可以比作细胞组织,使跟踪或识别不同的细胞群(124年]。因此,类似于分子化验,单个细胞分析在这种类型的系统允许快速检测细胞分泌的分子,由于每个封装细胞周围低容量。此外,正如交叉污染的风险减少,细胞可以通过各种技术分析主要是通过荧光检测(9]。此外,荧光检测可以应用附着和non-adherent单个细胞通过使用微流体设备结合光学系统,使孤立的单个细胞的操纵,也从中断的调查内容单个细胞(125年]。例如,许126年]描述了制备微液滴包含很少或单个细胞,通过检测荧光蛋白的表达在细胞同时测量液滴的大小、荧光和细胞入住率。同样重要的是单个细胞的可能性进行抽查时间课程,因为最后的反应的细胞群,不总是描述单个细胞的行为在某些时候,这通常是由一个孤注一掷的原则(10]。这种技术可以让我们获得更多关于转染特点的数据,当转染开始真正的点和理想的细胞株用于转染与特定核酸和转染方法。为了验证这种技术的潜在效用,施密茨(127年)使用下降点设备监控的水平β-galactosidase在人口单一酵母利用记者酶荧光技术以及监控酵母的增长速度。Boedicker [128年]显示的另一个重要应用这种技术:快速检测细菌的药敏检测样品没有pre-incubation可以产生快速而有效的针对病人的治疗细菌感染。他们决定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌谱,一种抗生素敏感菌株,对许多抗生素和测量的最低抑制浓度(MIC)药物头孢西丁对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和路口敏感和金黄色葡萄球菌的耐药菌株在复杂样品,像人类血浆(128年]。
另一方面,可以用来模拟水凝胶滴在体外多细胞生物提供一个3 d附着和non-adherent哺乳动物细胞的微环境。与绝大多数在体外细胞生物学研究,进行平面上使用单层细胞培养基质,3 d微环境概括生活的架构组织和包括生物化学和机械信号之间的动态相互作用提供的细胞外基质(ECM),和信息交互和可溶性因子(129年,130年]。这些水凝胶滴,由天然或合成聚合物,应该提供细胞吸附和扩散(131年]。贴壁细胞需要相对耐药基质,如胶原蛋白,锚拉周围,因为他们依赖于myosin-based收缩和细胞粘附[11]。此外,水凝胶可以改造,促进有效的基因转移与病毒性向量(12),也可以用于研究细胞通路内化纳米颗粒(132年]。达利瓦(12)识别细胞外基质(ECM)的蛋白质及其组合作为一个微环境,显著增强小鼠间充质干细胞(mMSCs)转基因表达。他们表明,蛋白质,增强细胞增殖细胞基因表达和传播也相应增加(12]。此外,研究转基因表达途径,达利瓦(133年RhoGTPases]显示,调节细胞之间的串扰和纤连蛋白(ECM)的结构组成部分,规范内化和有效的纳米载体导致细胞内处理有效的基因转移。
然而,也有一些缺点之前,必须考虑封装细胞,特别是当使用健壮的分析在很长一段时间,比如如何维持生存的细胞液滴内,合并的风险,养分耗竭或有毒代谢产物的积累9]。因此,以减少这些障碍通过防止液滴聚结,生物相容性surfactant-oil配方,使氧气分子扩散和防止泄漏的石油开发阶段(134年- - - - - -139年]。Clausell-Tormos [134年]证明了长时间使用此策略的可行性,通过培养附着和non-adherent哺乳动物细胞水微滴油质乳液系统长达两周,应用抽查分析细胞的技术可行性控制后的设备,也打破了乳剂恢复细胞几天之后。
在微流控液滴的情况下,涉及非混相阶段,其他重要的主题被认为是与微流控尺度相关的主要物理机制,如表面张力和扩散。一些研究小组(140年]探索这些参数,再加上定量测量液滴内生物科学和技术进步的目的。因此,为了保持一个液滴固定长期的观察和提供组合测量在一个单一的形象,Fradet [141年结合rails和锚与激光迫使微流控系统,使高度可控的2 d滴数组的创建。此外,在微流控液滴系统更快速传质会比在单相微流控系统中,由于不同液体间的界面面积比单位体积比较大(142年]。然后,Abbyad [143年]应用这个rails和锚设计控制运输氧气的细胞培养或诱导时间或空间变化液滴的气体含量,从而验证细胞内的脱氧血红蛋白的液滴的聚合封装红细胞从病人患有镰状细胞病。
此外,与微流体系统我们可以调查引起的剪切应力流如何影响转染效率。心(144年)描述了一种微流体装置研究剪切应力影响脂质体的转染效率/ DNA复合物主要培养的神经元,实现45%的转染。尤其是droplet-based系统、传质扩散现象是高度计算研究[145年- - - - - -147年)或实验仪器(148年- - - - - -150年),旨在获得一个适当的混合加速大规模运输里面滴。对于转染应用程序,与Abbyad [143年)系统,水滴可以保持固定甚至在不同外部流的存在,可以调查根据流的剪切应力细胞通过静止水滴。
Droplet-based工具单细胞分析关注的许多研究人员对许多不同的应用程序来说,尤其如此在体外转染的应用,主要是由于潜在的大规模筛选和封闭的个体microchambers的好处9]。因此,我们总结表2不同的方法使转染使用droplet-based微流体平台,静止的单个细胞的转染在微流体设备。
表2:不同来源的描述(电穿孔,显微镜下注射和纳米粒子)提供单细胞转染droplet-based微流体平台。
在特定的情况下使用droplet-based微流体平台在体外转染,单个细胞放置在与核酸,和物理刺激或病毒性向量是考虑提高转染效率。雷竞技网页版尽管一些系统使用两个非混相阶段(石油和水相)产生水滴,油的绝缘的财产延迟物理刺激作用于细胞(157年),这是因为一些研究小组更喜欢使用几何花招,像室158年和小孔159年- - - - - -162年),单个细胞在特定点的设备。特别是,光刺激使用瞬态激光领域,增加细胞膜渗透性允许核酸注入细胞内,这一过程被称为光学转染(163年]。然而,这种光学装置允许光注入和物理操纵细胞相同的激光源;换句话说,你可以通过激光力和保持细胞转染细胞即使没有滴室(一个接一个163年]。更一般的,常164年)发明了微流控生物应用droplet-based设备,包括合成生物学中所涉及的操作和使转染细胞克隆基因。
最常见的转染electrotransfection微流控设备,这是一个方法提供基因进入细胞通过应用外部电场,,由于划分,要求更低的电压比传统电穿孔,从而使更高的细胞生存能力(69年]。詹(151年]演示一个简单的微流控设备,封装细胞水水滴油流然后electroporates封装细胞;结果显示交付的增强绿色荧光蛋白(EGFP)质粒进入中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1),达到大约11%的转染细胞。因此,为了证明这个转染方法的潜力也在其他细胞,罗(152年)表明,荧光素可以通过应用引入酵母细胞低交流电压的非盟微电极。
此外,显微镜下注射可用于转染细胞在气液液滴系统中,使多种生物活性化合物的引入,包括核酸、单细胞到相同的目标,很难处理的常规方法(165年]。因此,李(153年)显示的可行性通过microvalve显微注射器在形成液滴微流控设备微针尖端允许,例如,在单细胞基因传递。
同样,纳米粒子,一般由生物聚合物或脂质,可以用作病毒性载体安全、可再生的基因传递到细胞。通常,水动力的影响,由机械和几何变化在液体,干涉微流控液滴设备包含nanocomplexes增强基因转移(69年]。流体动力学可以使用的液体流在弯曲的路径和长毛细血管,改善混合液滴内部,如果几何尺寸下降,与高压液体流,剪切应力的上升55,69年,166年]。类似于胫骨(144年陈,和同事154年EGFP)与质粒转染CHO-K1细胞编码,但在这种情况下,它是进行化学刺激,PolyFect activated-dendrimers包裹着pDNA,转染效率达到25%。我们强调了两个相关的点称为工作所示,第一个重要的一点是需要使用氟碳油为连续相由于其生物相容性的纳米颗粒细胞和小损失水油相,第二点是小水滴提供转染效率的增加可能是因为细胞之间更好的互动和配合物154年]。同样,Hufnagel [155年)转染CHO-K1细胞具有相同的报告基因,pEGFP,但使用polyplexes nanovectors,实现20%的转染效率。尽管这项工作方法模块化微流控系统,允许几个操作细胞里面,如播种、种植、操纵、超然,收集、封装和转染(155年]。最后,李和谢长廷(156年)发明了一种微流控液滴装置在哪里可能复杂的核酸与脂质体转染细胞在同一时间。他们编码绿色荧光蛋白转染pDNA u20细胞,转染率达到近50%,远高于转染的主要方法;从而证明这些系统的潜力在基因传递应用程序(156年]。
系统的小型化允许更好地控制反应,降低反应物的用量与传统方法相比。液滴方法提供了非常小的多分散性,然而粒子及其复杂的生产与核酸(粒子)微尺度范围。通过这种方式,必须作出许多努力为了转置已经报道传统方法生产的纳米粒子微流体系统。微流体技术的挑战一般都在增加。
细胞转染Microdroplets系统是一个有前途的未来,因为许多参数可以调查他们为了近似在活的有机体内转染条件。例如,水滴可以提交一个剪切应力提供了对流的贡献被添加到扩散运输nano-vectors细胞,像发生在复合物中插入某些组织或血管的特定部分。此外,水凝胶滴可以为细胞提供一个3 d环境与生活组织的体系结构,允许实现细胞的行为在体外更类似于在活的有机体内,考虑到生物化学和机械信号传输。
疾病与不同的原因,比如癌症,产生巨大的困难在建立一个对所有患者的配方,因此需要一个个性化的治疗。这样,转染通过纳米粒子在微流控液滴系统似乎是一个更合适的机制比使用电穿孔或显微镜下注射,为了研究核酸插入细胞基因治疗策略。因此,微液滴在初步分析系统是一个强大的工具来开发治疗性疫苗为每个单独的,因为他们似乎更类似于导致研究在活的有机体内转染并在大规模生产单分散的纳米颗粒。
这项研究是财务支持的圣保罗研究基金会(FAPESP]必须占州政府和协调改善高等教育的人员(披肩)。