在干旱胁迫下街反转位子活动的动态dna甲基化

文摘

太阳graveolens(街)是植物原产于地中海地区,提出了该地区自古以来的传统医学。有可怜的太阳和重复序列的基因组信息和主动移动遗传元素还没有被确认。自街基因组仍主要是未知的,和增殖能力和大尺寸的转座子让他们关键贡献者基因组大小和演化,我们旨在孤立和转座子序列特征,更好地了解基因组街。我们有孤立的小说类型的Ty1-copia像LTR逆转录酶从太阳graveolens,导致基因组组织和系统发育关系的调查。自从转位因子的激活在应对环境变化代表适应性反应生物压力的一种形式,我们调查如果干旱胁迫会影响转座子甲基化和甲基化的程度已经与表达水平有关。结果可以影响基因组街的理解和他们的潜在影响太阳之进化。

关键字

太阳之graveolens Ty1-Copia,胞嘧啶甲基化,亚硫酸氢盐测序,转座的元素

文摘

太阳之graveolens(街)植物原产于地中海地区,提出了该地区自古以来的传统医学。有可怜的太阳和重复序列的基因组信息和主动移动遗传元素还没有被确认。由于基因组街仍是大多是未知的,和增殖能力和大尺寸的转座子使其基因组大小和关键因素进化,我们旨在分离和转座子序列特征,以更好地了解基因组街。我们有孤立的小说类型的Ty1-copia像LTR逆转录酶从太阳graveolens,导致基因组组织和系统发育关系的调查。因为转位因子的激活来响应环境变化代表适应性反应生物压力的一种形式,我们调查如果干旱胁迫会影响转座子甲基化和甲基化的程度已经与表达水平有关。结果可以影响基因组街的理解和他们的潜在影响太阳之进化。

介绍

太阳之graveolens是属于芸香科属的一种植物。它主要功能灌木繁茂的植物,原产于地中海地区和礼物传统医学这个地区自古以来。它原产于欧洲南部,在地中海地区丰富的本地化,但是广泛分布在温带和热带地区,它还可以发现在干燥的岩石和无情的网站。三个最重要的物种是太阳chalepensis L。,太阳之graveolensl。和太阳之路montana, even if they are morphologically poorly differentiated and until today, phylogenetic relationships are supported by few molecular data. Ruta graveolens L. (Rutaceae), the Common Rue, also known as Herb-of-grace, is a species of “rue”, or 'ruda', grown as an herb. Rue has several therapeutic purposes worldwide. Recently, much interest is focusing on potential anti-inflammatory and抗癌作用太阳之精为人类治疗的目的。显著抑制作用在一些炎症介质破坏了小说这种植物的抗炎作用是记录了太阳之精的能力调节在诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和cyclooxygenase-2 (cox - 2)基因的表达及其对小鼠原始264.7巨噬细胞的抗氧化能力挑战与脂多糖(LPS)通过抑制核factor-κB (NF-κB)激活1- - - - - -3]。此外,太阳graveolens是为数不多的植物生产呋喃并香豆素、分子与建立治疗属性。呋喃并香豆素,体内,发挥保护作用对昆虫的攻击。尽管太阳graveolens应用程序作为人类潜在的抗炎和抗癌治疗的目的,分子方面的研究仍然微不足道,街街考虑限制文档的基因组,而且到目前为止,只有146序列存入基因库。目前,在街转座的元素还没有被确认。

转座的元素(te)的DNA序列能够从一个位置移动到另一个基因组。te已确定在所有生物,原核和真核生物,可以占领一个高比例的物种的基因组。转座的元素构成了大部分的基因组和负责的真核细胞DNA的质量。已经表明,te是在基因组功能和演化中起了重要作用[4]。Retroelements,类我转座的元素,是无处不在的,丰富的植物基因组的一部分,主要负责植物基因组大小变化(5]。自治LTR反转位子活动扮演了一个重要的角色在着丝粒功能和染色质结构,在他们在宿主基因组(调节基因的表达6]。然而,大量的可以灭活LTR-RTs DNA甲基化和小RNAmediated沉默机制。DNA甲基化也可以影响植物调节响应环境压力(7]。非生物压力如寒蝉、种植密度、摩擦,切割,一轮轮的亚文化一般修改DNA甲基化的水平(8]。

反过来,转座子活动与基因组稳定性的降低,是进一步相关hypomethylation水平(9]。hypomethylation和压力之间的关系曝光已被确认冷应激,考虑到它的修复hypomethylation在植物基因组在寒冷条件下,包括改变逆转录转座子序列(10]。几个具体的例子TE影响邻近基因的表达已经被记录,TE附近插入基因通过几个潜在的机制可能会影响基因的表达,包括插入cisregulatory区域内,贡献一个向外阅读从TE到基因启动子,或提供新的基因序列可以作为增强剂/积极调制的转录抑制因子绑定因素,或影响基因启动子区域的染色质状态(11,12]。一些工商业展览逆境应答的转录或运动4]。例如,表达式可以诱导烟草Tnt1元素的生物和非生物压力(13]。太阳的基因组graveolens尚未研究与逆转录转座子活性和对压力的反应或适应环境条件。自反转位子活动扮演了一个重要的贡献大小,组织和基因组的遗传多样性,表征街反转位子活动是很重要的。在此背景下,我们分析了异质性,基因组和转录活动的Ty1-copia街。在此,我们孤立和测序RT基因的一部分从Ruta graveolens copies-like反转位子活动,并把他们与发表的序列。多个联盟允许我们隔离11小说类型的Ty1-copia像LTR逆转录酶从太阳graveolens,主要探讨基因组组织,系统发育关系,转录活性和复制数据。此外,些微的目的研究DNA甲基化反应的变化干旱压力街copia-like序列,我们眼镜蛇进行分析。有趣的是,我们发现实质性的改变一些RT序列的表达,而不是改变序列特定甲基化在太阳graveolens叶子和干旱胁迫下根。结果允许我们获得一个初步的理解DNA甲基化街,暴露在干旱胁迫,也转位因子的基因分布和序列的分析可能有助于我们理解他们对太阳进化的潜在影响。

材料和方法

植物材料和基因组DNA隔离

从物种的植物叶片收集芸香料家庭,即太阳之graveolens,太阳chalipensis,Citrulismon(左)发热管。(柠檬)c .试;c . sinensis;c .橙L。,柑橘天堂金花蛇,Fortunella玛格丽塔不悦之色。击打(金橘)和枳壳trifoliata。植物从集合中取得了植物园ofNaples,意大利。植物叶子groundinto液氮的细粉,和总基因组DNA提取使用DNeasy植物迷你包(试剂盒)后,制造商的协议。DNA浓度测定样品的吸光度测量在260海里。

干旱胁迫处理和评估

干旱的实验中,街的种子植物被种植在10月和12锅锅(30厘米直径)充满了壤粘土土壤使用标准方法在1996年被悬疑类。短暂,粘土37%,淤泥砂25%与pH值7.7,35%提到过0.59,1.30有机物、可溶性离子HCO (maq土壤/ 100克)₃^{- - - - - -}0.69,Cl^{- - - - - -}2.1,所以^{- - - - - -}1.12和可溶性阳离子(毫克当量/ 100 g土壤)Ca + + 1.11, 0.88毫克+ +,Na + 2.23 K + 0.19。每一罐含有三种植物,其中两个植物叶子和两个根采集标本,第一个在开花的开始阶段(3月底),第二个在开花阶段(6月)。街植物干旱胁迫下从6罐是扣水直到土壤湿度下降到12%。与re-watering复苏后,每个植物的生长参数和Ty-copia表达式值测量。在干旱胁迫条件下获得的值意味着±SE (n= 48)统计与正常情况下不同的值(n = 48) (p< 0.05)。

亚硫酸氢转换和眼镜蛇(亚硫酸氢结合限制分析)

亚硫酸氢研究p1c3序列的甲基化程度,执行转换使用217 EZ DNA Methylation-Gold™工具根据制造商的协议(ZYMO研究、综合科学、经纪公司、车澳大利亚)。500 ng基因组DNA的量用于亚硫酸氢转换。亚硫酸氢转化基因组DNA受到使用铂聚合酶链反应(PCR)^®Taq DNA聚合酶(英杰公司企业。有限公司、布莱克本、澳大利亚)。引物设计使用引物3 Primer3计划(http://www.bioinformatic.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi)。PCR成立如下:1 x铂聚合反应缓冲区,1毫米MgCl2, 100 nM核苷酸混合,400海里的引物RT TY-copia和0.05单位的Taq由超纯™蒸馏水(英杰公司企业。有限公司、布莱克本、澳大利亚)20μl最后一卷。PCR是由最初的变性为94.0°C 5分钟,其次是40 94°C的周期为30秒,30秒58°C, 72°C 45秒,最后通过扩增子72°C伸长10分钟。PCR产品(大小217个基点)可视化在1.7%琼脂糖凝胶。限制片段长度分析PCR产品限制内切酶孵育MspI(甲基化199 bp + 107个基点,229 unmethylated 306个基点),(新英格兰生物学实验室Inc . Genesearch Pvt Ltd .) Arundal,昆士兰,澳大利亚)。基因组DNA隔绝太阳担任unmethylated眼镜蛇控制。基因组DNA的样本处理231 CpG甲基转移酶。拟建(新英格兰生物学实验室Inc . Genesearch Pvt Ltd .)担任积极的甲基化控制。

结果与讨论

移动序列描述在大多数植物导致基因组可塑性,因此,我们旨在证明存在RT Ty1-copia组反转位子活动序列太阳之graveolens基因组。使用特定Ty1-copia对反转位子活动退化寡核苷酸引物,扩增PCR预期大小的产品,获得了260个基点,从基因组DNA街。目标PCR产物copiaRT域被切割和筛选了凝胶,净化,克隆并测序。一百二十四个独立的克隆分离克隆街后基因组DNA带放大copia-specific底漆和测序。其中,96年克隆(总额的70%)显示与theTy1-copia RT序列的序列同源性植物属于不同分类群。相比RT-Ty1地区已知的反转位子活动从植物基因组,氨基酸相似范围从58.0%到73%(数据没有显示)。13个克隆(15%)17时停止密码子克隆(19%)拥有frame-shifts有或没有停止密码子。因此,总共30克隆(假定的RT克隆的34%)被发现有瑕疵。252年帧手动修正后的转变一些克隆,克隆70终于选择进一步进行系统发育分析。系统发育分析显示高水平的序列之间的异质性克隆街整体平均为38%,他们至少可以分为十一个不同的家庭(图1和2)。街copia RT前者序列的比对和NJ-tree建设序列从其他植物揭示了非常有趣的结果(图1)。八街Ty1-copia RT家庭更严格相关代表元素出现在其他植物物种远离芸香料家庭。例如,一些RT Ty - copia。前者太阳之路序列(HM210869、HM210871 HM210872、HM210873 HM217180, HM217182和HM217183)更密切相关的RT Ty1-copia像出现在开花植物寄生,如Orobanche(ABD18986)和Phelipanche(ABD19090)属(图1)aminoacidic相似性为77%至88%。Orobanche和Phelipanchenon-photosynthetic (holoparasitic)植物,缺乏任何光合活性和完全dependenton宿主。此外,一个copia-RT序列显示,69%与逆转录酶隔离在265相似之处Medicagotruncatula附录(ABN06064) (S1)。

p3c11,值得注意的是,三个孤立的RT序列p3c1, p3c4克隆(资源库加入数字HM210870 HM210869,分别HM210872),有关反转位子活动中发现几个属于柑橘属亚科,大多数种类的姐妹群太阳之graveolens(图2)。这样的序列与copia-RT分享87%到99%的序列相似性的序列柑橘类植物,素类(CAJ41389),柠檬(AAC02552),植物(AM1177429),柑橘类天堂(DQ414756)。R之间的关系。graveolens和c . sinensis序列之前已经报道过aschalcone合成酶基因和吖啶酮合成酶显示查耳酮合成酶翻译核苷酸序列太阳之路有大约90%的身份素类同系物,吖啶酮合成酶序列股票75%到85%从其他植物多肽序列的身份与chs家庭(14]。支持转位因子之间的关系在我们的研究和其他标识芸香料植物,翻译太阳之路序列已被发现与C密切相关。中国和c·克莱门汀transposon-similar蛋白质。遗传元素迁移被描述为一个基本机制导致柑橘类植物的表型变异(15]。报告说,西西里岛的血橙起源于一个retrotransposition copia-like移动元素的相邻花青素合成的转录激活因子,控制催化剂表达式通过cold-mediated机制[16- - - - - -20.]。

这就提出了一个问题为什么Ty1-copia RT序列仍然是守恒的太阳之路和柑橘类植物,属于两个不同的亚科芸香料。为了解释这一现象,我们可以推测这个元素,提供一些额外的函数选择优势芸香料。转座子参与染色体的结构,在着丝粒和端粒,他们扮演着重要的角色在染色质修饰和应激反应(21,22]。Ty1-copia序列的太阳之路和柑橘类属可能导致基因功能和调节的多样性和生物多样性的来源。Despitetheir增殖能力,转录和/或置换的活动大多数retroelements压抑通过宿主基因组表观遗传机制的结合涉及转录和转录后的控制(23]。然而,在某些基因和环境条件,如充满敌意的环境,病原体,和受伤,主机压迫可能会失败,导致大规模和情景性活化和增殖24- - - - - -30.]。DNA甲基化在不同组织和不同发展阶段,环境压力和在实验条件下拍摄再生组织培养愈伤组织诱导。5-methylcytosine水平(5 mC)强烈不同植物中,占25%的玉米(胞嘧啶31日]。每个工厂研究显示高水平的基因组甲基化限制重复和转座的元素(32- - - - - -41]。胞嘧啶甲基化甜菜基因组研究中重复序列,包括反转位子活动和DNA转座子,揭示一个微分叶子和其他组织中甲基化大米,Tos17换位的愈伤组织与DNA hypomethylation [42]。DNA甲基化失活过程中起中心作用的转座子。全基因组的方法发现应激动态DNA甲基化变化的独特方面,包括hypomethylation之间的关系、生物起源的具体siRNAs和转录脱抑制转座子序列。街我们问自己,如果是其他的植物,可以利用一个特定的压力下的一系列防御机制和转座子序列可以通过DNA甲基化,调制和突变体缺乏全球CG non-CG甲基化显示诱导表达。

这里,亚硫酸氢和限制(眼镜蛇)进行分析以确定在Ty1-copia序列的甲基化状态太阳之路干旱胁迫下。亚硫酸氢联合限制分析(眼镜蛇)是一个量化的方法DNA甲基化在一个特定的基因区域由bisulfite-treated PCR扩增的DNA。结果显示大量的DNA hypomethylation水平调查CpG网站(图3)。这个实验支持我们的假设,在干旱、应力触发loci-specific街基因组甲基化变化。表观遗传景观可以动态修改;的确,广泛的改变可以引起DNA甲基化压力、植物受到热应力显示瞬态核小体密度的变化,以及转录抑郁,在一些重复的元素和移动元素(43]。

随后,我们调查是否Ty1-copia DNA甲基化的程度是负相关的微分表达水平Ty-copia在干旱胁迫下表达[街44- - - - - -51]。街逆转录转座子转录活动的特点研究了定量实时聚合酶链反应(存在)方法模拟干旱胁迫下一共有12个人,12个人在正常湿度条件。转录分析街Ty1-copia像序列(这里叫p3c4、p1c3 p3c5和p3c10)揭示了微分基因表达太阳之路干旱胁迫下的组织与控制(图4)。所示图4转录水平较高,一些Ty1-copia序列显示相比,干旱胁迫下根叶子和控制。的确,结果显示大量的DNA hypomethylation水平调查CpG网站(图4)与qPCR数据一致,显示出显著增加表达相比,干旱胁迫下根叶子和控制。

te转录活动只是演示了几个工厂,只有在压力条件下激活(52]。在太阳,尽管基因突变和细胞控制,测试工程师管理转录活跃,和转录监管在转录后水平上通过动态DNA甲基化变化。

结论

总之,我们的研究是第一个深Ty1-copia反转位子活动的报告太阳之路。反转位子活动尚未被描述在街中,最古老的国家之一芸香料组。转座因子序列和基因分布更广泛的分析将有助于我们理解他们的潜在影响进化街和多样性芸香料家庭。在我们的研究中,我们将演示在街retrotransposon-like序列的转录激活(太阳之graveolens平行的)暴露在干旱胁迫后改变特定甲基化序列。鉴于突出角色扮演的生物和非生物压力的进化历史,人们很容易得出这样的结论:一个或两个这些因素可能参与了这些那时。太阳之路物种可能会成为一个优秀的小组研究的生态和进化动力学LTR逆转录转座子激活和增生。然而,进一步的实验将有必要揭示epi-genetic监管机制这种植物的应激反应。

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