动态监测对小鼠的免疫保护机制诱导重组棘球绦虫granulosus p-29蛋白质(Reg.P-29)

文摘

包虫病是一个世界性的致命感染引起的人畜共患绦虫的棘球绦虫属的物种。棘球绦虫granulosus(例如)抗原已被证明具有保护性免疫对继发感染。在目前的研究中,一个诊断抗原P-29重组,表达和纯化。结合Eg.P-29 (rEg。P-29)作为候选疫苗被用于小鼠进行免疫接种,和免疫保护,这种保护机制进行了分析。雌性老鼠的三组,A组、B和C腹腔免疫与完整注册P-29 Freund佐剂(CFA)在PBS,分别或磷酸缓冲盐(PBS)。两周后额外两个助推器,老鼠与2000年挑战如protoscoleces(已经)腹腔内。收集血清样本和脾脏从小鼠在不同时间点牺牲每组5只老鼠。血清中抗体的淋巴细胞和细胞因子在上层的文化测量。结果表明,与对照组相比,小鼠免疫与rEg P-29表明,免疫球蛋白水平,IgG1, IgG3 IgG2b以及2、il - 4和IFN-γ一次或多次免疫后显著增加,但无论是IgG2a还是IgE。 Nevertheless, after mice inoculated with rEg.P-29 was challenged, CD4 + and CD8 + subsets significantly enhanced which implied that CD4 + and CD8 + subsets could enlist the protective immune mechanism (P<0.05). Therefore, as a promising candidate for an effective vaccine to prevent secondary Echinococcosis, protection against Eg protoscoleces induced with rEg.P-29 was associated with humoral and Th1 cellular responses.

关键字

棘球绦虫granulosus、诊断抗原P-29 immunoprotection机制,候选疫苗

介绍

包虫病,一个古老但仍人畜共患感染发病率高发病率在世界上大多数包括欧亚大陆,北部和东部非洲,澳大利亚,南美洲和中国的大部分省份,是由成人或属于属绦虫的幼虫阶段棘球绦虫(1,2]。它发生在各种器官(主要是肝脏和肺)的人类和动物可以引起严重的甚至致命的疾病,和高的感染率也代表了一个相当大的公共卫生负担自治疗非常昂贵,在大多数未经治疗的患者感染致命的(2),这样一系列的治疗包括手术技巧的改进,化疗和介入过程开发(3]。相信激进手术是首选治疗可能导致完全治愈;然而,切除往往不完全因为扩散和未被发现的寄生虫与宿主组织渗透。化疗建议激进手术后或长期有限时间或不完整切除病变的情况下操作,但化疗本身通常不能杀死寄生虫和随后的一系列副作用和耐药性。

最近,极大的影响了开发疫苗,高效便捷的方法,减少发病率和棘球蚴病的传播4]。这是证明的中间宿主大肠granulosus由鸡蛋长寿和感染引起高度的保护性免疫。因此,它已被用于高效疫苗的发展。疫苗被证明带来高度的防范与不同地理隔离的挑战大肠granulosus暗示它可能有广泛的适用性作为一种新的方法用于水分控制活动(2]。疫苗提供了有价值的方式来帮助控制这个重要的人类病原体的传播,同时也有可能防止棘球蚴病直接通过疫苗接种的人类,和大多数食草动物已接种成功对抗病毒或细菌疾病,它表明,寄生虫病疫苗可以大大有助于正常农场实践(5]。疫苗接种中间宿主是一个新兴的领域,近年来大幅推进重组疫苗的发展后Taeniaovis感染羊(6]。任何成功的认识到中间宿主的免疫反应,最终在生产一种有效疫苗可能导致人类感染的下降和经济损失的动物。现在的重组蛋白可作为immune-detection或候选疫苗候选抗原的选择如(7- - - - - -10]。

P-29, 29-kDa抗原如metacestode-specific组件,可能是另一个有用的诊断抗原的如评估免疫大P-29和的主要诊断抗原5之间。(Ag5) [11]。在先前的研究中,我们成功地构建质粒P-29 / pET28a,把它转化成如大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS为抗原制备和纯化。小鼠接种注册。P-29和挑战腹腔内如protoscoleces显示与对照组相比显著的保护性免疫96.6% (12]。在这项研究中,我们进一步评估纯化的免疫保护机制的动态注册。P-29 ICR小鼠,揭示相关抗原的免疫保护作用。

方法

材料

抗原的制备

质粒。P-29 / pET28a变成了大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS和重组E。杆菌是建造在我们先前的研究。蛋白表达在一夜之间37°C诱导的isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG Promega)在最后一个1毫米的浓度。r。P-29从转化的提取纯化大肠杆菌BL21 (DE3)镍螯合亲和色谱法(Novagen)根据制造商的指示。分析了纯化His6-tagged蛋白12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)凝胶。蛋白质含量是由布拉德福德法(13]。

动物和寄生虫

动物实验都是严格按照指南进行的护理和使用实验动物,宁夏医科大学生物伦理学委员会批准,132名女性ICR小鼠,6周大岁了(宁夏医科大学实验动物中心,银川,中国),随机分为3组(A组,B和C, n = 44每组)。如。protoscoleces已经被收集从肥沃的如无菌,从肝囊肿和肺感染的羊。收集到的已经在磷酸盐缓冲盐水洗(pbs - 1%)和汉克斯平衡盐溶液(美国圣路易斯σ)含100 U /毫升的青霉素G和100毫克/毫升的硫酸链霉素。的生存能力已经被台盼蓝排斥试验确定。只有那些批次包含超过90%的已经被用于小鼠感染。

疫苗接种感染和挑战

老鼠在对照组(C组)皮下注射接种疫苗在后面只有100μl PBS, B组用50μl CFA在50μl PBS,和组接种10μg rEg。P-29 50μl PBS的弗洛伊德佐剂乳化三次(第一次免疫在CFA周0,紧随其后的是两个辅助免疫不完整Freund佐剂(IFA)在周2和4)。第三个疫苗两周后,小鼠与2000年挑战可行已经腹腔内。

调查的特定抗体

免疫后血清抗体反应与rEgP-29或PBS被ELISA根据量化发表文献[14]。与他们相比,血清抗体的ELISA反应量化0,2,4,6,7,10,31周开始的实验,介绍了免疫和post-challenge研究的阶段。96孔酶标(中美生物技术公司)被涂上注册。P-29(10μg / 100μl /)的隔夜孵化0.1碳酸盐缓冲(pH值9.6)在4°C。血清样本稀释在PBST 1:10 0 (PBS Tween-20 0.05%)和测试一式两份。结合抗体被发现HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g和免疫球蛋白子类(Novagen)在PBST 1:1000稀释,和OD值ELISA抗体在490 nm阅读的读者(Bio-Rad)。

细胞因子的测定

脾细胞与小鼠感染之前和之后的挑战在体外实验中。5×10⁶淋巴细胞每毫升被维持在37°C公司为5%₂RPMI 1640中含10%热灭活胎牛血清,2毫米谷酰胺,2-mercaptoethanol 25毫米。细胞被刺激与5μg /毫升伴刀豆球蛋白a上层清液100μl 72 h文化收集和储存在-20°C。

光密度值细胞因子由ELISA (Jingmei生物技术公司)决定。淋巴细胞文化的上层清液添加到涂井的96孔板,和维持在37°C 2 h。与PBST洗后,50 ng biotinconjugated抗体被添加到每个好另一个2 h在37°C;然后再用PBST洗净。50 ng peroxidase-labeled链霉亲和素被添加和孵化为1.5 h在37°C,紧随其后的是第三次洗涤和衬底加法和孵化为0.5 h在37°C。最后,反应是停在添加100μl 2 M硫酸。光密度测量在490 nm ELISA读者(Bio-Rad)。

统计分析

数据分析使用SPSS 16.0版,用单向方差分析与Dunnett测试。p < 0.05的值被认为是显著和所有结果平均数±标准差。

结果

动态调查免疫球蛋白水平,免疫球蛋白和IgE的同形像

OD值的免疫球蛋白和IgE前后免疫小鼠感染所示图1。不同阶段选择抗体检查:0周(免疫之前),2^nd(第一次免疫后2周),4^th(2周后2^nd免疫),6^th(2周后3^{理查德·道金斯}免疫),7^th(在感染后1周),10^th(在感染后4周)和31^圣(25周后感染)。通过我们的研究,效价的免疫球蛋白抗体免疫增加倍增加(图1 f)。收集的抗血清免疫小鼠6、8、10、18 - 31所示^圣星期后免疫含有免疫球蛋白抗体效价高而免疫球蛋白抗体反应控制小鼠(P < 0.01)。OD值IgG1、IgG3 IgG2b免疫组均高于对照组的4、6、10、18^th周(P < 0.05) (图1 b, c和1 e)。此外,我们还发现,效价的IgE高于对照组与其他时间点相比(P < 0.01) (图1一个)。然而,OD值IgG2a免疫组和对照组没有显著性差异(图1 d)。

动态调查脾细胞CD4子集⁺和CD8⁺T细胞

OD值的免疫球蛋白和IgE前后免疫小鼠感染所示图2。不同阶段被选为抗体检查一样图2。两个CD4⁺和CD8⁺从免疫后2周增加到18周(2个月后感染),最高的水平。有严重的区别与rEg小鼠接种疫苗。P-29 PBS + FCA和PBS。

动态调查细胞因子

2、il - 4、il - 10, IFN-γTNF-α上层清液的测定脾细胞感染后6个月作为Th1、Th2免疫反应的指标,以及il - 10的免疫抑制指标(图3)。细胞取自rEg。P-29免疫小鼠和相同抗原刺激分泌高Th1细胞因子(- 2和IFN-γ)与B组或C(相比图3和3 d)。- 2分泌细胞的小鼠免疫rEg。P-29显著增加之前已经被挑战(第三次免疫后2周)。il - 4和IFN-γ越来越倾向从0 31周^圣的一周。il - 10没有显示越来越感染注册之前或之后。P-29组与对照组相比图3 b和3 d)。然而,TNF-α明显高于B和C组与A组相比,感染后(图3 e)。

讨论

理想的动物模型是地下室棘球绦虫学习。随后的因素是:动物类型,年龄和性别。张,郑10已经被感染,传染率分别为94%和89.28%。这意味着老鼠的合适的宿主如健康发现最好的CE是年轻女性敏感的小鼠动物模型。在这项研究中,ICR小鼠6周和在18到22岁的克重量的选择,和腹部囊肿在5个月后,这意味着模型ICR感染如成功,这对免疫机制调查后铺平道路。

寄生虫感染宿主诱导体液免疫和细胞免疫的两个方面。体液免疫的保护效果如不仅与免疫球蛋白的水平,但也与免疫球蛋白的同形像。最早的免疫球蛋白对包虫囊肿液和cospheralAgs出现2和11周后,分别在小鼠和羊挑战如的鸡蛋或oncospheres (15]。将下面描述,这些antioncospheral Abs发挥重要作用在寄生虫杀死,中央对Eg的保护性免疫反应。在慢性阶段的CE、高浓度的Ab,特别是免疫球蛋白和IgE [16),发生在人类身上,IgG1和IgG4主要(17- - - - - -19]。IgG1和IgG3水平显著增加8周之后发布的挑战和居高不下(20.]。在我们的研究中,特定的免疫球蛋白,IgG1, IgG3 IgG2b与rEg显著提高小鼠免疫。与对照组相比P-29如上所述,这意味着全部或部分的这些抗体与免疫系统是相对的。IgE OD值没有意义免疫组和对照组之间的差异除了10^th星期(4周后感染)。我们认为原因是IgE增加早期,我们可能错过了最佳时间,而原因挑战已经在10时迅速上升^th周是诱导型超敏反应。

信息生成的细胞反应如和重组疫苗是有限的。尚不清楚是否cellmediated反应发挥作用在主机防护如然而,一些间接的证据表明,这些反应可能是重要的。二级。包虫囊肿质量如疫苗接种的老鼠(EG95)耦合到波士顿咨询公司降低了近93%,这是与高浓度的2,IFN-γ,TNF-α和降低il - 4,表明Th1反应可能发挥重要作用对挑战这种疫苗感染模型(21)确定Ags的寄生虫的感染性幼虫阶段包含在oncospheres接种疫苗的潜在诱导高水平的保护主机。通过我们的实验,探索与rEg免疫小鼠的影响。P-29对后续二级包虫病的结果和相关的免疫反应。通过这种方式,目前的方法不仅引用和改进之前的研究调查接种的小鼠与生活所产生的免疫反应或死PSC (22- - - - - -25),但也immunoprotection近年来重组蛋白的研究(21,26]。在我们的研究中,2、il - 4和IFN-showed显著增加7^th周(一周后感染)注册。P-29组。此外,主导- 2在rEg感染后的第一个星期。P-29免疫小鼠,这可以被视为Th1大于Th2反应的指标。感染前il - 4水平显著升高,这表明il - 4主要由注册。P-29但不是病原体已经在这项研究中。il - 4被报道与刺激成熟B细胞的增殖、分化和协助驱动类切换IgE在寄生虫免疫中发挥着关键作用。il - 10没有显示越来越感染注册之前或之后。P-29组与控制相比出现明显增加从早期感染实验终止。这些结果支持先前报道的影响il - 10的研究如感染或其他候选疫苗重组测试(27- - - - - -29日]。但如何注册。P-29抑制分泌il - 10的老鼠已经被挑战,需要进一步的研究。脾细胞CD4子集上的动态调查的结果⁺和CD8⁺T细胞CD4显示⁺和CD8⁺从免疫后2周增加到18周(2个月后感染),最高的水平。有严重的区别与rEg小鼠接种疫苗。P-29 PBS + FCA和PBS。所以我们推测,CD4细胞⁺和CD8⁺由rEg.P-29 T细胞被激活。

显然,免疫与注册。P-29导致有效的免疫保护与其他两个对照组相比,在囊肿减负荷没有显著差异。提供注册的基础。P-29宝贵的疫苗。体液和细胞因子反应保护起到了重要作用。然而,这种免疫系统是由于抑制免疫逃逸的如或直接引起特定的抗体或所扮演的角色都需要进一步的调查。

确认

这项工作得到了从宁夏自然科学基金赠款(没有。NZ15077)。

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