重组细粒棘球绦虫p-29蛋白诱导小鼠免疫保护机制的动态监测

摘要

棘球绦虫病是由棘球绦虫属的囊虫种引起的世界性致命人畜共患传染病。细粒棘球绦虫(Eg)抗原已被证明对继发感染具有保护性免疫。在本研究中，对诊断抗原P-29进行了重组、表达和纯化。结合Eg.P-29(rEg。用P-29)作为候选疫苗免疫小鼠，并对其免疫保护作用及其机制进行了分析。A、B、C三组雌性小鼠分别在PBS或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以完全弗氏佐剂(CFA)和rEg P-29腹腔免疫。在另外两个助推器后两周，小鼠腹腔内受到2000个Eg原头节(PSCs)的挑战。每组取5只小鼠，在不同时间点采集血清和脾脏样本。检测血清抗体及淋巴细胞培养上清细胞因子。结果显示，与对照组相比，接种rEg P-29免疫的小鼠经1次或多次免疫后，IgG、IgG1、IgG3、IgG2b水平及IL-2、IL-4、IFN-γ水平均显著升高，而IgG2a和IgE均无明显升高。 Nevertheless, after mice inoculated with rEg.P-29 was challenged, CD4 + and CD8 + subsets significantly enhanced which implied that CD4 + and CD8 + subsets could enlist the protective immune mechanism (P<0.05). Therefore, as a promising candidate for an effective vaccine to prevent secondary Echinococcosis, protection against Eg protoscoleces induced with rEg.P-29 was associated with humoral and Th1 cellular responses.

关键字

细粒棘球绦虫，诊断抗原P-29，免疫保护机制，候选疫苗

简介

棘球蚴病是一种古老但仍然流行的人畜共患传染病，在世界大部分地区，包括欧亚大陆、北非和东非、澳大利亚、南美洲和中国大部分省份发病率很高，是由属于该属的卵虫的成虫或幼虫阶段引起的棘球绦虫［1，2］．它发生在人和动物的各种器官上(主要是肝脏和肺)，可导致严重甚至致命的疾病，这种感染的高比率也代表了相当大的公共卫生负担，因为治疗非常昂贵，感染对大多数未经治疗的患者是致命的[2]，因此已发展出一系列治疗方法，包括改良手术技术、化疗及介入性手术[3.］．认为根治性手术是治疗该病的首选方法;然而，由于寄生虫弥漫性和未被发现的浸润到宿主组织，切除通常是不完整的。在根治性手术或不能手术的病例中，不完全切除病灶后，建议在有限或长期内进行化疗，但化疗本身通常不能杀死寄生虫，并伴有一系列副作用和耐药性。

近年来，降低包虫病发病率和传播的一种高效、便捷的方法——疫苗的研制取得了很大的效果[4］．经实验证明，其中间宿主大肠granulosus它们寿命长，被卵子感染能激发高度的保护性免疫。因此，它已被用于开发高效疫苗。该疫苗已证明对不同地理分离株的挑战具有高度保护作用大肠granulosus暗示它作为一种新方法在水化防治活动中具有广泛的适用性[2］．该疫苗为控制这种重要的人类病原体的传播提供了一种有价值的方法，它也有可能通过对人类接种疫苗来直接预防包虫病，而且大多数放牧动物已经成功地接种了病毒或细菌疾病的疫苗，这表明针对寄生虫病的疫苗可以极大地帮助正常的农场实践[5］．中间宿主疫苗接种是一个新兴领域，近年来随着绵羊带绦虫感染重组疫苗的开发取得了长足进展[6］．在识别中间宿主的免疫反应并最终生产出有效疫苗方面取得的任何成功都可能导致人类感染的减少以及动物的经济损失。许多重组蛋白现在可作为Eg的免疫检测或候选疫苗选择的候选抗原。7-10］．

P-29是一种来自Eg的29-kDa抗原，是一种metacestode特异性成分，通过评价P-29与Eg主要诊断抗原5之间的免疫交叉反应，可能是另一种有用的Eg诊断抗原。(Ag5) [11］．在前期研究中，我们成功构建了质粒P-29/pET28a，将其转化为大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS并纯化用于抗原制备。用rEg接种的小鼠。与对照组相比，腹腔内用Eg原头节挑战P-29的小鼠显示出显著的保护性免疫，达到96.6% [12］．在本研究中，我们进一步评价了纯化rEg的免疫保护机制的动态。对ICR小鼠P-29进行免疫保护作用的研究。

方法

材料

抗原的制备

质粒。在前期研究中，将P-29/pET28a转化为E.coli BL21 (DE3) pLysS，构建了重组E.coli。在最终浓度为1 mM的异丙基-β- d -硫半乳糖苷(IPTG, Promega)存在下，37℃过夜诱导蛋白表达。P-29是从转化大肠杆菌BL21 (DE3)的提取物中通过镍螯合亲和层析(Novagen)根据制造商的说明纯化的。纯化的his6标记蛋白在12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上进行分析。采用Bradford法测定蛋白质浓度[13］．

动物与寄生虫

所有动物实验均严格按照《实验动物的护理和使用指南》进行，并经宁夏医科大学生命伦理委员会批准。获得6周龄雌性ICR小鼠132只(宁夏医科大学实验动物中心，银川)，随机分为3组(A、B、C组，每组44只)。如。原头节(PSCs)采用无菌法从可育Eg和感染羊的肝、肺囊肿中采集。收集的PSCs在含100u /ml青霉素G和100mg /ml硫酸链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS-1%)和Hanks平衡盐溶液(Sigma, St. Louis, USA)中洗涤。台盼蓝排除法测定PSCs的活力。只有那些含有90%以上存活PSCs的批次被用于小鼠感染。

接种疫苗和挑战感染

对照组(C组)仅用100 μl PBS接种小鼠背部皮下免疫，B组在50 μl PBS中接种50 μl CFA, A组接种10 μg rEg。P-29在50 μl PBS中以弗氏佐剂乳化，共接种3次(第0周第一次接种CFA，第2周和第4周第2次接种不完全弗氏佐剂(IFA)加强免疫)。第三次接种2周后，腹腔内接种2000个活的PSCs。

特异性抗体研究

rEgP-29或PBS免疫后的血清抗体反应根据已发表的文献[14］．与之相比，本研究在实验开始后的0、2、4、6、7、10和31周采用ELISA法定量血清抗体反应，涵盖免疫阶段和攻毒后阶段。96孔微孔板(中美生物技术公司)涂上rEg。P-29 (10 μg/100 μl/孔)在0.1 M碳酸盐岩缓冲液(pH 9.6)中4℃孵育过夜。血清样本在PBST(含0.05%吐温-20的PBS)中1:100稀释，并进行重复测试。用酶标山羊抗小鼠IgG和IgG亚类(Novagen)在PBST中1:1000稀释检测结合抗体，并在酶标仪(Bio-Rad) 490 nm处读取抗体OD值。

细胞因子测定

在攻毒感染前后分别从小鼠中分离脾脏细胞进行体外实验。5×10⁶每ml淋巴细胞维持在37°C和5% CO₂在RPMI 1640培养基中加入10%热灭活胎牛血清、2 mM l -谷氨酰胺和25 mM 2-巯基乙醇。用5 μg/ml刀豆苷a刺激细胞，取72 h培养的上清100 μl， -20℃保存。

细胞因子光密度值采用ELISA法测定(京美生物科技公司)。将淋巴细胞培养物上清加入96孔板的包被孔中，37℃维持2 h。用PBST清洗后，每孔加入生物素偶联抗体50 ng, 37℃再维持2 h;然后再用PBST清洗。加入过氧化物酶标记链霉亲和素50 ng, 37℃孵育1.5 h，洗涤第三次，加入底物，37℃孵育0.5 h。最后，加入100 μl的2 M硫酸，使反应停止。在ELISA阅读器(Bio-Rad) 490 nm处测量光密度。

统计分析

数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，采用Dunnett检验进行单因素方差分析。p<0.05为有统计学意义，所有结果均以均数±标准差表示。

结果

IgG水平、IgG和IgE同型的动态研究

免疫小鼠感染前后IgGs和IgE的OD值分布图1．选择不同阶段进行抗体检测:0周(免疫前)，2周^nd(首次免疫2周后)^th(2周后2^nd免疫),6^th(2周后3^{理查德·道金斯}免疫),7^th(感染后1周)，10^th(感染后4周)和31^圣(感染后25周)。通过我们的研究，IgG抗体滴度随着免疫次数的增加而增加(图1 f)．分别于免疫小鼠6、8、10、18、31日采集抗血清^圣免疫后各组IgG抗体效价均高于对照组(P<0.01)。免疫组4、6、10、18时IgG1、IgG3、IgG2b的OD值均高于对照组^th周(P<0.05) (图1B、1C和1E)．此外，我们还发现与其他时间点相比，IgE滴度高于对照组(P<0.01) (图1一个)．而IgG2a的OD值在免疫组与对照组之间无明显差异(图1 d)．

脾细胞亚群CD4的动态研究⁺和CD8⁺T细胞

免疫小鼠感染前后IgGs和IgE的OD值分布图2．选择不同阶段进行抗体检查同图2．两个CD4⁺和CD8⁺从免疫后2周增加到18周(感染2个月后)，均为最高水平。接种rEg的小鼠之间存在显著差异。P-29 PBS+FCA, PBS。

细胞因子动态研究

感染后6个月测定脾细胞上清液中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α作为Th1、Th2免疫应答的指标，IL-10作为免疫抑制的指标(图3)．细胞取自rEg。P-29免疫小鼠和同种抗原刺激小鼠分泌的Th1细胞因子(IL-2和IFN-γ)高于B组和C组(图3A及3D)．rEg免疫小鼠细胞中IL-2分泌的变化。PSCs攻毒前P-29显著升高(免疫3次2周后)。IL-4和IFN-γ在0 ~ 31周呈升高趋势^圣的一周。rEg感染前后IL-10均未见升高。P-29组与对照组比较(图3B及3D)．但B、C组感染后TNF-α明显高于A组(图3 e)．

讨论

理想的动物模型是棘球绦虫学习。影响因素包括:动物类型、年龄和性别。张、郑[10]，感染率分别为94%和89.28%。这说明小鼠是Eg健康的适宜宿主，发现CE的最佳动物模型是雌性幼龄敏感小鼠。本研究选取6周龄、体重18 ~ 22 g的ICR小鼠，5个月后腹部出现囊肿，成功建立了感染Eg的ICR模型，为后续的免疫机制研究铺平了道路。

寄生虫感染宿主诱导体液免疫和细胞免疫两个方面。Eg体液免疫的保护作用不仅与IgG水平有关，而且与IgG同型有关。对包虫囊液和球囊ags最早的IgG反应分别出现在小鼠和绵羊用Eg卵或肿瘤球挑战2周和11周后。15］．如下所述，这些抗球抗体在杀灭寄生虫中起着重要作用，是对Eg的保护性免疫反应的核心。在CE的慢性期，Ab水平升高，特别是IgG和IgE [16]，以IgG1和IgG4为主[17-19］ ．IgG1和IgG3水平在攻毒后8周显著升高，此后持续升高[20.］．在我们的研究中，rEg免疫小鼠特异性IgG, IgG1, IgG3和IgG2b显著升高。P-29与对照组比较如上所述，这意味着这些抗体全部或部分与免疫保护相关。免疫组与对照组的IgE OD值除10外无显著性差异^th一周(感染后4周)。我们认为原因是IgE很早就升高了，我们可能错过了最佳时间，而原因是在10时用PSCs挑战时IgE迅速升高^th周诱发型超敏反应。

关于Eg和重组疫苗产生的细胞反应的信息有限。目前尚不清楚细胞介导的反应是否在宿主对Eg的保护中发挥作用。然而，一些间接证据表明，这些反应可能是重要的。次要的;次要的与卡介苗偶联的Eg疫苗(EG95)免疫小鼠的包虫球囊体积减少了近93%，这与IL-2、IFN-γ和TNF-α水平升高以及IL-4水平降低有关，这表明Th1反应可能在该疫苗模型中对挑战感染起主要作用[21]该研究从肿瘤球内包含的寄生虫感染幼虫阶段鉴定出Ags，有可能在接种疫苗的宿主中诱导高水平的保护。通过本实验，探讨了rEg对小鼠的免疫作用。P-29对继发性包虫病结局和相关免疫反应的影响。因此，本方法不仅参考和改进了前人研究的接种活的或死的PSC小鼠产生的免疫反应[22-25]以及近年来重组蛋白的免疫保护研究[21，26］．在我们的研究中，IL-2、IL-4和ifn在7时均有明显升高^th(感染后一周)。P-29组。此外，IL-2在感染后第一周在rEg中占主导地位。P-29免疫小鼠，这可以被视为Th1反应大于Th2反应的指标。感染前IL-4水平明显升高，提示IL-4主要由rEg诱导。P-29，而不是本研究中的病原体PSCs。据报道，IL-4与刺激成熟B细胞的增殖和分化有关，并有助于推动类别向IgE转换，IgE在寄生虫免疫中起关键作用。rEg感染前后IL-10均未见升高。P-29组与对照组比较，P-29组感染早期至实验结束均显著增加。这些结果得到了先前关于IL-10在Eg感染研究或其他重组疫苗候选试验中的作用的报道的支持[27-29］．但是rEg。P-29抑制PSCs损伤小鼠IL-10分泌，有待进一步研究。脾细胞亚群CD4的动态研究结果⁺和CD8⁺T细胞均显示CD4⁺和CD8⁺从免疫后2周增加到18周(感染2个月后)，均为最高水平。接种rEg的小鼠之间存在显著差异。P-29 PBS+FCA, PBS。所以我们推测CD4和⁺和CD8⁺T细胞被rEg.P-29激活。

显然，用rEg免疫。与其他两个对照组相比，P-29组具有有效的免疫保护作用，在减少囊肿负荷方面无明显差异。这将为rEg提供基础。P-29是一种有价值的疫苗体液和细胞因子反应在这种保护中起主要作用。然而，这种免疫保护是由于Eg抑制了免疫逃逸，还是由于特异性抗体直接起作用，或两者皆有，尚需进一步研究。

确认

基金资助:宁夏自然科学基金(No. 1);NZ15077)。

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