研究与评述:微生物与生雷竞技苹果下载物技术杂志
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本于1，2、陈佳2李登2、孙兵1吴先林2，3.赵长林2，4、张丽1孙敏1戴聪奇2，5、吴莎6蒋振友6陈小银2*
收到日期:08/03/2015;接受日期:02/25/2016;发表日期:03/07/2016
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的菌群失调肠道菌群中的促炎和抗炎肠道相关淋巴组织中的因子，导致体内先天和适应性免疫反应的减少，并诱导肺部疾病的发展。然而，潜在的机制仍不清楚。在本研究中，我们首次通过灌胃的方法建立了细菌失调的动物模型抗生素然后在小鼠身上感染流感病毒FM1。分析菌群失调后TLR7和RLRs免疫识别通路的表达水平变化。这些结果为阐明肠道菌群平衡在维持机体免疫识别中的重要性提供了证据。
菌群失调;TLR7;RLRs
研究表明，肠道菌群在维持机体免疫功能方面起着重要作用。然而，抗生素的滥用破坏了肠道菌群的正常平衡，导致肠道菌群失衡促炎以及肠道相关淋巴组织中的抗炎因子，它降低了体内的先天和适应性免疫反应，并诱发了哮喘等肺部疾病的发展。
toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)和rig - i样受体(RIG-I-like receptor, rlr)作为机体重要的免疫识别机制，在识别入侵微生物、激活先天免疫系统、发挥抗病毒活性等方面发挥着关键作用。我们之前的研究[1研究表明，抗生素诱导的小鼠菌群失调抑制了TLR7信号通路mRNA和蛋白的表达水平，导致T细胞相关因子IL-4和IL-10水平升高，IFN-γ和IL-17水平降低。治疗后益生菌IL-4、IL-10水平显著降低，IFN-γ、IL-17水平显著升高。给予益生菌可提高TLR7信号通路中基因和蛋白的表达水平，表明肠道微生物群在维持TLR7信号的识别机制中具有重要作用。
本研究使用不同的抗生素建立不同的细菌失调动物模型。在此基础上，小鼠感染了流感病毒目的:建立细菌失调合并流感病毒感染的动物模型。分析肺部病毒感染后，肠道菌群对机体TLR7/ rlr免疫识别的影响，探讨肠道菌群平衡维持机体免疫识别的机制。
实验分组及模型建立
选用广东省医学实验动物中心SPF BALB/c小鼠72只，随机分为4组，每组12只，分别为对照组(c)、病毒感染模型组(V)、菌群失调模型组(D)、菌群失调和病毒感染组(D+V)。对照组不进行任何治疗。采用20%LD50 FM1病毒(A/FM1/1/47，由暨南大学医学院免疫与微生物学系提供)，从实验第14天开始，通过鼻内感染建立V组病毒感染小鼠模型，持续4 d。D组和D+V组分别口服3种不同抗生素14 D，建立肠道菌群失调小鼠模型。本实验使用的剂量为0.45 g/kg体重灭滴灵头孢拉定和新霉素0.30 g/kg体重。根据我们之前的工作报道，给菌失调小鼠模型14天[1]。此外，D+V组小鼠也按照上述方法感染FM1病毒。所有实验均按照暨南大学动物实验委员会指导原则进行。
菌落平板计数
从盲肠取1 g样品，在第18天连续稀释10倍，然后分别涂于辉瑞选择性肠球菌琼脂、紫红胆汁琼脂- mug、MRS琼脂和BBL琼脂(广州环凯微生物检测公司)上进行培养肠球菌，大肠杆菌、乳酸芽孢杆菌,双歧杆菌．厌氧琼脂用于厌氧细菌板计数。肠球菌,大肠杆菌、乳酸芽孢杆菌在37℃好氧条件下孵育24 h，而厌氧细菌和双歧杆菌37℃厌氧条件下孵育48 h (AN0035, AnaeroGen bag, Oxoid AnaeroGen System, Oxoid)。然后进行平板计数，以log CFU/g量化每种细菌的生长情况。
半定量实时聚合酶链反应测定和western blot
用Beyozol试剂(海门北天生物科技有限公司)从肺组织中分离总RNA，沉淀后用逆转录试剂盒(北京天根生物科技有限公司)进行反转录。以GAPDH作为内控。本实验所用引物均由上海Generay生物科技有限公司合成。所有蛋白均采用western blotting方法定量，如我们之前的工作所述[2]。TLR7和RLR通路抗体来自CST公司(美国波士顿)，稀释比例为1:1000,GAPDH来自TransGen Biotech北京公司，辣根过氧化物酶标记抗体(1:1000)来自Proteintech Group，芝加哥，伊利诺伊州。最后，增强化学发光，化合光采用海门天宇生物科技有限公司的免疫反应条带进行鉴定。
统计分析
数据分析采用SPSS for Windows (version 19)软件。组间差异的显著性采用单因素方差分析，P< 0.05为差异有统计学意义。所有值都用平均值±SEM表示。
菌落平板计数
三种不同的抗生素治疗可以减少优势菌群的数量，因为减少了细菌的数量乳酸菌，双歧杆菌，肠杆菌,肠球菌(P < 0.05)。病毒感染肺部的数量也减少了肠道菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌，和厌氧细菌总数。与D组相比，肠球菌，乳酸菌,双歧杆菌合并菌群失调和病毒感染后呈持续下降趋势;然而，只有减少乳酸菌和双歧杆菌均有统计学意义(P<0.05);图1）.
图1:各组小鼠盲肠上不同选择琼脂的菌落平板计数。以log CFU/g量化每种细菌的生长。经学生t检验，a对b P<0.05。
TLR7和RLR信号通路的mRNA和蛋白水平
结果显示，病毒感染后，与TLR7、MyD88、RIG-I、NF-κB、MAVS相关的TLR7、RLR信号通路mRNA和蛋白表达呈显著升高趋势，差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，D组的识别机制下调，TLR7、MyD88、RIG-I、NF-κB呈显著降低趋势(P<0.05)。MAVS 25 kDa蛋白也呈下降趋势(P<0.01)， 75 kDa呈上升趋势。与V组相比，菌群失调合并病毒感染时，TLR7-和RLR相关信号通路mRNA和蛋白表达减少，提示菌群失调可抑制TLR7和RLR信号通路的激活，导致识别能力下降病原体．与D组单纯菌群失调模型相比，病毒感染可导致菌群失调后小鼠TLR7和RLR免疫识别信号通路相关基因的表达略有升高;然而，这一趋势并不显著。TLR7、RLR信号通路蛋白表达均呈下降趋势，其中TLR7、MyD88、NF-κB表达趋势显著(P<0.01);图2-4）.
图2:实时RT-PCR条形图显示TLR7和RLRs信号通路基因相对mRNA表达的变化。数据归一化为GAPDH对照。所示数据为三个独立实验的平均值，每个实验进行三次(平均值±SE)。各图a与b、a与c、b与d经方差分析P<0.05。
图3:检测肺组织中TLR7、MyD88、RIG-1、NF-κB、MAVS的相对蛋白水平。作为负载控制，测定相对于GAPDH蛋白水平的蛋白值。数据以至少三个独立实验的平均值±SE表示。各图a与b、a与c、b与d、c与d的方差分析均P<0.05。
图4:各组tlr和RLRs蛋白表达情况。以GAPDH作为加载对照。分子量如下(以kD为单位):TLR7, 140;MyD88 33;RIG-1, 102;NF -κB, 65;MAVS, 75和52。免疫印迹定量分析显示，病毒感染后，TLR7、MyD88、RIG-1、NF-κB、MAVS水平显著升高，菌群失调组显著降低。
肠道微生物群与机体先天免疫和病原体相关模式识别受体的调节有关。它们的动态平衡在维持机体免疫功能与肠道菌群之间的共生关系中起着重要作用[3.]。肠道菌群菌群失调会导致小鼠免疫反应降低，胃肠道粘膜屏障受损，抗体合成或分泌功能障碍，以及呼吸系统疾病的发生。肠道免疫功能异常常引起肠道细菌过度生长，细菌易位，诱发或加重多器官功能衰竭。在这项研究中，用抗生素治疗小鼠，成功建立了细菌失调的动物模型。然后进行病毒感染，研究菌群失调对机体TLR7/RLR免疫识别机制的影响。
结果显示，病毒感染导致肠道微生物群的变化和细菌数量的减少肠道菌，肠球菌，双歧杆菌，厌氧菌和乳酸杆菌，这表明肠道菌群的变化引起的病毒感染可能会引起肠黏膜相关系统的炎症反应。
TLRs和rlr作为主要的病原微生物识别受体，可以诱导DC成熟，促进免疫细胞释放炎症因子对抗病原微生物的入侵。toll样受体(TLRs)识别PAMPs，并通过myD88依赖的TLR/IL-1R信号通路上调myD88、IRAK (IL-1R相关激酶)、TRAF6 (tnf受体相关因子)等相关因子的表达，从而诱导NF-κB的活化[4]和TNF、IL-6、proIL-1β和proil -18、IL-12p35和I型干扰素的释放[5，6]。RLR家族包含三个成员:rig - 1、黑色素瘤分化相关基因5 (MDA5)和LGP2(遗传和生理实验室-2)。RIG-I识别病毒RNA的5 ' -ppp ssRNA和短链dsRNA, MDA5识别长链dsRNA [7]。病毒被识别后，进一步与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)相互作用，导致IRF3/7活化、I型干扰素产生和NF-κB活化。据报道，tlr和rlr通过DC p38 MAPK和IRF信号通路调节CD4+ T细胞分化[8]。
病毒感染后，TLR7和RLR信号通路中基因和蛋白的表达水平显著升高，说明病毒感染可诱导机体激活免疫识别受体通路，有效清除病毒入侵。肠道菌群菌群失调导致TLR和RLR信号通路下调，引起NF-κ b诱导的TNF、IL-6等炎症因子的释放，以及IRF激活诱导的IL- 12p35和I型干扰素的释放，从而抑制IL-6和IL-10的产生。IL-6和IL-10与Th2和Treg的分化密切相关，说明细菌失调诱导的TLR和RLR信号通路下调可抑制Th2和Treg的激活，诱导机体促炎反应和过度免疫反应的增强。病毒感染后rig - 1的表达呈上升趋势，这有利于病毒从体内清除。肠道菌群菌群失调导致RLR信号通路下调，不利于病毒清除，说明肠道菌群菌群失调影响肺部疾病的进展。MAVS是线粒体抗病毒信号蛋白，存在于T细胞、单核细胞和树突状细胞中。MAVS激活可诱导下游NF-κB和IRF-3信号通路的激活，调节炎症因子水平和IFN-γ表达水平。本研究表明，病毒感染后MAVS蛋白表达呈上升趋势，说明病毒感染可激活MAVS在体内的表达，发挥其抗病毒活性。菌群失调后MAVS的变化与RIG-I的变化不一致。结合上述抗体阵列数据和流式细胞术数据显示，研究中使用的三种抗生素的影响是不同的。 In addition, MAVS activation was associated with RIG-I or MDA5; however, MDA5 was not analyzed in this study. It was possible that MDA5 also exerted its regulatory mechanism during the process of dysbacteriosis.
本研究推测，FM1病毒感染后，菌群失调加重了小鼠肺组织的炎性渗出物，肠道菌群失调可下调肺部TLR7和RLR的免疫识别机制，诱发机体先天免疫机制异常。因此，免疫反应功能无法发挥，从而降低了从肺部清除病毒的能力。正常的肠道菌群在维持机体免疫功能和识别机制方面具有重要意义。
YB, CJ, DL和CX构思和设计了实验。YB、DL、DL、SB、WX、ZC、DC和WS进行实验。YB, CJ, ZL, SM, CX分析数据。YB, CJ, DL, JZ和CX提供了试剂，材料和分析工具。YB, DC, CJ和CX撰写了手稿。
国家自然科学基金项目(No. 81273616)、教育部博士学位基金项目(No. 20104401110003)、广东省自然科学基金项目(No. 81273616);S2013010013434)，广州市科技计划项目(2014J4100106)。
