Ecotox——监视水生生态系统的污染和有毒物质

文摘

在世界范围内迅速增加污染工业、市政和农业起源是一个主要的威胁自然水生栖息地,水库为娱乐目的和饮用水供应。多种有机和无机毒素不能被详尽的化学分析监控。因此很多生物已经发展了最近监测水生态系统分析生物的生化和行为反应作为预警仪器来检测潜在的毒物在水里。光合运动型鞭毛虫(眼虫属股薄肌)被用于新一代Ecotox仪器13生理和解剖参数被评为终点包括运动性,游泳速度,gravitactic取向以及细胞形态和大小。仪器操作行评估大量的生物在视频序列的运动矢量实时保证高统计学意义。

关键字

水生生态系统、眼虫、Ecotox、鞭毛虫、生物监测、生态毒理学,污染物。

介绍

尽管三分之二的地球被水覆盖,只有一小部分远远低于1%可用液态淡水(1]。然而,工业,家庭对淡水的需求和农业增长指数在过去30年里,预计将进一步增加(2]。有限的淡水资源是进一步增加国内污染的威胁,工业和农业废物重金属、持久性有机污染物(POP),化肥、农药和医药3]。全球气候变化的后果影响降雨模式预计将恶化情况(4]。特别是发展中国家的情况是戏剧性以来约有7.8亿人无法获得干净的淡水(5和22亿缺乏安全卫生6]。这些条件也将进一步恶化由于全球气候变化7]。有限的水资源,地下水位下降,不断上升的气温和降水的变化必然会降低农业生产力(8,9]。世卫组织估计,每年大约有500万人死于与水有关的疾病,如腹泻和由水性寄生虫感染。

从有毒物质会导致水污染点源等行业的废水(10]。或者它可以来自传播来源,比如农业或市政废物(11]。锌、铜、铅、Cd、汞、镍、铬等重金属污染物广泛发生在水生生态系统和饮用水水库如地下水、湖泊和河流。这些物质进入水从行业或采矿废物未经处理的废水12,13]。重金属往往是在水生生物和生物积累达到高水平等食物网鱼或鸟和消费者对人类构成威胁14]。例如,Cd一直在观察积累水生生物浓度因素从102年到105年(15]。类似的浓度的重金属在河流被发现在巴基斯坦和印度16,17]。

持久性有机污染物和无机化学品都是严重的毒素在水生栖息地可以丰富沉积物(18]。或者他们是集中在食物网,因此目前威胁整个生物群(19]。最近,个人护理产品和药物雌激素等集中在河水中回收和增强浓度(20.]。激素浓度可以达到诱发女性化在鱼类和两栖动物,对人类的负面影响(21,22]。氯酚化合物来自工业废水、农药和氯化烃的降解产物23]。他们认为是一些最有毒的污染物,因为他们的高毒性、化学稳定性和低降解性(24,25]。

因为再见,水生生态系统的持续增加的污染监测和评估饮用水供应以及废水处理具有较高的优先级。化学分析是昂贵,耗时,并且通常无法检测大量的毒素,因为潜在的有毒物质(26];在addtition,他们可能低估了混合物的毒性的化学物质,这些物质可能协同作用27]。此外,上限为污染物在水生生态系统不同国家和随着时间的推移,可能不能反映生物的潜在威胁(28]。

化学分析的替代是部署bioassys监控水质。许多不同类型的生物已经开发使用死亡率、能动性和行为,增长和physiolocial参数如光合作用、蛋白质biosynthsis和水生生物的遗传改变端点(29日]。生物用于此目的包括细菌和微生物、昆虫、鱼类、软体动物以及藻类和高等植物用来监视毒性的淡水水库饮用水或娱乐使用,以及确定潜在的有毒物质在市政,工业和农业废水(30.- - - - - -32]。

根据定义,不确定生物毒素的化学性质在水中,但信号污染物的存在和显示不良反应的浓度范围,例如通过确定effect-concentration曲线曲线(EC)。为此这表明执行一系列稀释污染物浓度最高,不会引起对端点检测影响(没有观察到的效应浓度,NOEC)。经常EC50值确定指示导致50%抑制浓度(33]。一系列稀释导致100%的浓度抑制叫做致死剂量(LD) [10,34]。

实现一个成功的方法使用光合鞭毛虫Ecotox系统监控几个运动和定位参数影响大范围的潜在污染物使用在线实时图像分析游泳细胞(35,36]。当前工作的目的是描述的新开发的新一代基于增强Ecotox系统视频技术和新颖的图像分析系统。

生物体的生物测定

原则上,任何类型的能动的有机体从细菌到大型动物可以用于生物测定。根据生物的大小只放大等光学参数需要调整。例如,microcrustacean水蚤在国际上被认为是一个合适的能动的有机体敏感许多污染物和毒素37,38]。还的病菌的能动的细菌已经使用;在这种情况下最好暗场照明

下面描述的光学条件优化了就业的单细胞光合鞭毛虫眼虫属股薄肌野生型菌株z文化是来自凹陷(Sammlung·冯·Algenkulturen哥廷根大学)(39斯塔尔(发表),生长在一个中等40)在22岁ºC在低光照条件下(25 W m 2混合温暖的基调和日光荧光管)在静态锥型文化。细胞用于实验>接种后10 d老,因为他们需要一些时间来开发一个持久gravitaxis(见下文)。微生物的增长非常简单,细胞快速增长,所以,没有复杂的文化环境需要保留

硬件

新一代的硬件ECOTOX包含光学单元连接一个观察室、鞭毛虫的游泳,单色USB相机(灰色,黑蝇BFLY-U3-13S2M-CS) 1.3像素的分辨率(1288 x 964)。10倍的显微镜物镜用于细胞移动的形象投射到CCD相机的目标(图1)。

监视是一个红外LED的光源为了不引起光合或phototactic鞭毛虫的反应,和辐射扩散两个聚四氟乙烯磁盘。步进电机泵传输一个新的鞭毛虫暂停观察室。第二个泵是用来冲洗室和连接管,和第三个传输可能有毒的样本。鞭毛虫悬挂、冲洗或稀释水和不良样品混合彻底混合室进入观察前室。所有三个泵由Arduino大型2560微机控制基于Atmel AVR单片机ATmega2560这档节目的特点就是大量的输入/输出(I / O)针以及大量的模拟数字输入(a / D)。微处理器控制电子板(Sparkfun.com) quadstep可驱动4步进电机为1.8°决议(位于莱茵河畔NEMA 17 DamenCNC,荷兰)附带一个蠕动泵(PP60)。步进电机允许精确的剂量的液体,以保证准确稀释毒素。4 x 20字符液晶显示器显示当前行动如泵是活跃或程序当前正在运行的一部分。硬件+ 3,12 V开关电源集成作为一个紧凑的块是安置在一个容器也有液体的容器和浪费。

图像分析软件和硬件控制

该软件是基于开源软件斐济的进一步发展ImageJ [41]。通常只ImageJ过程录像.avi序列;因此软件插件用于允许直接输入在线视频的成像软件(阶段,吕贝克,德国)。

ECOTOX软件,写在ImageJ的宏语言,首先启动摄像头控制,然后允许用户输入一个选择的帧数(栈)。阈值对比度增强和背景减法每一帧后导致白色物体的黑色背景。从这些帧运动矢量的能动的对象(256)进行了分析。确定的角方向运动。

由于光学仪器是面向水平垂直,从而观察室,gravitactic取向可以提取的细胞。眼虫属细胞可以检测地球的引力场的方向和东方自己相应的向上或向下的一个活跃的过程称为gravitaxis [42,43]。分析周期性重复,直到一个预定义的跟踪数量已确定或预定义的时间长度,不管。方向分布显示在一个圆形的直方图;部门可以由用户的数量和更新每次循环后通过一个新的视频帧序列(图2)。

运动的方向是计算的角度偏差从垂直α。

在y₂和y₁每个记录的结束和开始坐标,分别,同样的x坐标(44]。定位的精度计算热阻,这是一个统计测量运行0(无规取向)和1之间(所有的细胞都在同一方向移动)。

的平均角运动是作为θ。

从运动的角度向上游泳细胞的百分比计算(±垂直向上左右)。的游泳速度是决定(蜿蜒)总路径和游泳作为直线从头到尾的向量。这种比例的直接计算路径长度除以实际路径覆盖。过滤器可以由用户定义的限制分析对象大于最小面积和小于最大区域,以避免跟踪潜在的令人不安的粒子如细菌或气泡。也可以选择游泳速度在一个定义的窗口,以避免跟踪如non-motile,但沉积物细胞。运动性的百分比计算移动生物(大小定义)内所有检测到的对象。

所有分析对象的面积计算。此外,周长(外边界的长度),循环,圆度,可靠性和纵横比(粒子的主要和次要的轴比的拟合椭圆)以及Feret直径的计算显示对象的最大尺寸和Feret角,这是最长的角度轴水平。

对所有参数平均值和标准偏差计算决定。由于尺寸校准运动和尺寸参数计算实际物理单位(μm、μm2μm / s))。最终结果表保存在硬盘上实验的时间和日期,以及评论用户的实验条件。

ECOTOX系统可以运行在多个模式。单个实验是进行细胞在特定情况下。另外,系统可以通过编程首先泵一个未受污染的细胞悬液(控制)到观察室进行了分析。这个新的细胞悬液混合后自动与污水样本或有毒物质,然后进行分析。最后一个稀释的序列可以执行在毒素的浓度增加根据预先确定的序列。

这些泵功能通过发送一个命令执行的主程序通过USB电脑Arduino微处理器,这回声接收到的命令,以确保它是正确的。首先,微处理器的串行端口连接自动确定。电机控制的命令包括等细节,电动机的选择(细胞悬液、清洗、稀释水和有毒的样本),每个电动机运行时(等于液体的体积泵)和泵的方向。而且文化观察室的温度可以请求。这是显示在液晶显示器的ECOTOX硬件以及发送到主要PC程序存储结果文件中的值。

ECOTOX系统的数据可用于计算effect-concentration曲线(图3)和获取信息等毒性NOEC、LD和电子商务₅₀值(36]。系统可以申请短期以及长期(在线)监测污染的表面或废水。

适用性和评估

相比其他常用的生物,ECOTOX的主要优点是低成本和短的测量时间(10]。与其他一些系统,运营成本几乎可以忽略不计,只涉及眼虫属文化。自图像分析和运动参数计算进行在线实时图像分析,测量一个完整的循环包括控制和样品,大约需要6到10分钟35,45]。运行系统是用户友好的,不需要大量的训练人员。由于系统自动执行所有分析充分,用户测量和解释错误是可以避免的。使用全系列13运动和取向参数作为结束点的可靠性和灵敏度提高ECOTOX系统[10]。ECOTOX废水样本被发现的敏感性高于其他生物如藻类(增长),水蚤(活性),鱼(死亡率)和细菌(发光)36]。根据定义,生物监测系统不识别污染物的化学性质,所以需要一个化学分析发现如果一个潜在的威胁。然而,由于不同的能动性和取向参数显示不同的敏感性不同群体的毒素,第一次的迹象可以推导出污染物的潜在群体。

第一代ECOTOX一直利用检测的生物影响广泛的污染物如重金属、除草剂、杀虫剂、肥料、洗涤剂、废水和其他许多有机和无机污染物10,46- - - - - -48]。它已经被有效地用于测试短期和长期污染物的生态毒性10,49]。生物测定可以作为早期预警系统利用污染检测表面,市政和工业废水以及监测污水处理工厂的效率。因为它的低成本,系统还可以使用在发展中国家贫困资助和缺乏环境专家阻碍有效的水质监测。

在当前配置ECOTOX系统使用眼虫属作为模式生物,但它可以很容易地适应其他小型能动的有机体通过改变观察室和相机的尺寸放大。ECOTOX仪器和软件可以获得各种配置的实时计算机(Mohrendorf,德国,www.dphaeder.de)。

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