真菌的形成在体外的松果体elliottii和松果体armandii与松茸中国西南部的分离株

摘要

松茸是一种外生菌根食用菌，具有较高的生态和经济价值。的菌根日本和芬兰松茸分离株的体外合成已得到详细研究和广泛报道。然而，迄今为止，在受控的实验室条件下，中国松茸分离株体外合成菌根的形态解剖特征还没有详细的描述。在本研究中，我们利用纯培养板系统，证明了来自中国西南部的松茸分离株可以与外来树种湿地松和本土树种华山松形成良好的外生菌根。菌根关联包括真菌的地幔鞘和发达的Hartig网。湿地松(P. elliottii)在世界范围内广泛种植，在木材和树脂工业中具有重要的经济价值，而华山松(P. armandii)原产于中国，在中国中部和西南部广泛种植。有趣的是，在纯培养平板系统中，湿热伞菌根的形成比华氏伞更早、更丰富。本研究结果为国内外松茸栽培研究提供了新的视角，也为中国松茸和华氏松茸菌根苗的繁殖提供了新的思路。

关键字

外生菌根真菌，食用菌栽培，松果体armandii，松果体elliottii，松茸

介绍

松茸(S. Ito & S. Imai) Singer在中国也被称为song-rong或song-koumo，是一种非常受人尊敬和具有商业价值的外生菌根担子菌蘑菇。该种分布在整个北半球，包括亚洲国家(日本、中国、不丹和韩国)、欧洲国家(芬兰、法国、意大利、瑞典、挪威、德国和瑞士)和北美[1-3.]。在中国，适合的栖息地t .日本松茸主要分布在两个主要地区:中国西南部，包括云南省、四川省、西藏自治区和贵州省;中国东北部，包括黑龙江省和吉林省[4，5]。由于过度的商业采集和对适宜栖息地的破坏，自然种群t .日本松茸在中国、日本等主要产地已显著减少甚至灭绝[6]。因此，自然种群的保护和管理t .日本松茸已被列为国家二类传染病濒临灭绝的自1999年以来在中国的物种[7]。

植物的主要寄主植物t .日本松茸是日本红松(Pinus densiflora Sieb)。在日本、朝鲜和中国东北的森林中[8，9]。在北欧，t .日本松茸主要与苏格兰松(Pinus sylvestis)和冷杉云杉(Picea abies)有关。岩溶(10]。其他寄主树包括日本亚高山森林中的冷杉和多叶铁杉[11]、中国东北及朝鲜半岛的针叶松、美洲松、蒙古栎[12]，云南松，华山松，松果体armandii中国西南部及不丹属、甜槠属、栎属、石果木属及白檀属[13，14]。除了这些自然宿主，t .日本松茸已被实验证明与桦树白桦(Betula platyphylla var. japonica)和安第斯雪松(Andean Cedrela hererae)有关在体外［15-17]。

自然界中寄主植物种类繁多，更突出了寻找更好的寄主关系的意义t .日本松茸在在体外菌根合成。t .日本松茸从芬兰分离出来的形成菌根在本地樟子槐和冷杉幼苗上在体外，但日本孤立的人没有[10]。因此，一个比较在体外菌根的合成实验是必要的，其中原生或外来植物的种类和组合t .日本松茸来自不同地理位置的分离物。在寻找更好的寄主植物的过程中t .日本松茸隔离YN₁来自中国西南部，我们发现外来的湿地松(松果体elliottii形成广泛的菌根t .日本松茸YN₁克隆。p . elliottii原产于美国东南部，在世界各地都有种植[18]。由于其生长快、适应性广、树脂含量高等显著特点，被引进中国12个省份造林[19，20.]。

华人社团的发现t .日本松茸与外来松树分离p . elliottii很有趣。然后我们进一步评估的定殖水平p . elliottii通过与土著树松果体armandii，广泛分布于中国中部及西南部[21]。本研究的目的是探讨两者之间的关系t .日本松茸还有这两棵针叶树在体外使用纯培养培养皿系统合成菌根[22]，并对这些外生菌根的形态解剖特征进行了比较描述。

材料与方法

真菌的分离及接种物的制备t .日本松茸

t .日本松茸YN₁分离株为2014年采于中国云南省南化县的一株子实体。纯培养菌丝保持在改良的Pachlewski培养基上，培养基中酵母提取物1g，葡萄糖20g，麦芽糖5 g，酒石酸铵0.5 g, KH2PO4 1g, MgSO4.7H2O 0.5 g，硫胺hcl 0.1 g，微量元素原液1 mL (1 L微量元素原液中含H3BO3 8.45 g, MnSO4 5 g)。每升水:H2O、FeSO4.7H2O 6g、CuSO4.5H2O 0.625 g、ZnSO4.7H2O 2.27 g、(NH4)2MoO4 0.27 g。pH调至5.8后，在121℃下蒸压20 min。

八到十个小的菌丝体切片t .日本松茸母培养物转移到无菌250 mL玻璃烧瓶中，其中含有100 mL液体改性Pachlewski培养基。在23°C黑暗中静止培养1 ~ 2个月后，将菌丝体作为接种物合成菌根。

植物幼苗的无菌培养

的种子p . elliottii和p . armandii均为湖北省林业局提供，4日保存至利用。为发芽，在液氮中处理30秒，然后用30% H2O2表面消毒30分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗几次。将种子放在无菌的1%水琼脂培养基上，在培养皿中23°C的黑暗条件下发芽6天，23°C的光照条件下发芽3天。发芽后，将没有微生物污染的幼苗移植到生长/合成板上。

无菌菌根合成接种

菌根合成在大型塑料培养皿(直径150毫米)中进行。用深层不含蔗糖的半强度MS培养基(Murashige and Skoog 1962, SIGMA-ALDRICH, USA)灌注培养皿。在MS培养基表面放置无菌玻璃纸膜以防止根在其中生长。用无菌钳取幼苗，种植在平板中间的玻璃纸膜上。底片用胶膜密封(Bemis公司，Inc.)美国)，下半部分用铝箔包裹，以防止光照影响根系和菌根的发育。组板，然后保持在大约的角度。75°在生长室中，在23°C恒定的条件下，光照16小时，黑暗8小时。生长3 ~ 5 d后，将液体培养菌丝接种于根系。然后将培养皿放回生长室。 2 cm shoot cuttings of Populus trichocarpa with internodes were used as control.

菌根的观察

在立体显微镜(Olympus SZX16)的帮助下检查菌根。横切面取假定菌根根尖，切2 ~ 3 mm段，固定于FAA固定液(10% (v/v)甲醛、50% (v/v)无水乙醇、5% (v/v)乙酸)中，分级乙醇系列脱水，石蜡包埋(中国国药化学试剂有限公司)。用显微切片机(Thermo Microm HM360)获得10 μm厚度的连续切片，并附着在显微镜载玻片上。切片在二甲苯中脱蜡，通过分级乙醇系列再水化，用溶解在50%乙醇中的1%藏红花素O染色。然后用乙醇清洗，然后用80%丙酮中的0.1%坚牢绿染色切片。

在光学显微镜(Olympus BX51, Japan)下观察样品，并使用MicroPublisher 5.0 RTV摄像机连接到显微镜下拍摄图像。

真菌的分子鉴定

基因组用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法从孢子粒、菌丝体培养物和菌根尖端提取DNA [23]。引物对ITS1F/ITS4 (Gardes and Bruns 1993)用于扩增基因组核糖体RNA基因(rDNA)的内部转录间隔区(ITS)。优化的聚合酶链反应(PCR)条件如下:94°C 4 min，然后依次进行35个循环，94°C 30 sec, 56°C 30 sec和72°C 60 sec，最后一步72°C 5 min。在所有运行中均包含无DNA的阴性对照，以检测可能的污染物。PCR产物由商业测序服务公司(Quintarabio Co. Ltd, China)测序，所用引物与扩增所用引物相同。集合代表共识的Contigs，并对其进行BLAST搜索真菌GenBank中的序列。本研究的原始序列存放在GenBank，登录号为MF521936、MF521937、MF521898和MF521899。

结果与讨论

分子分析at .日本松茸与西南地区隔绝

ITS-rDNA区域的核苷酸序列t .日本松茸YN₁隔离(GenBank acc.)MF521898)与其母子果(GenBank acc.;MF521936)。ITS序列t .日本松茸YN₁与日本分离株AB968622进行比较[11]，芬兰分离物GQ904716 [10]，另一个发表了来自中国东北的ITS序列GU134497 [24]。这些分离株ITS区域(642个碱基对)之间没有变化(补充材料表1)，因此分离株YN₁被证实是t .日本松茸．

表1:ITS序列的比较t .日本松茸YN₁用从Genbank数据库中检索到的相应序列进行分离。

纯培养系统菌根化

采用纯培养板体系，定殖t .日本松茸的侧根尖上的p . elliottii接种约2个月后观察到，但对p . armandii在这个时候。侧根上开始出现明显的菌根形态p . armandii接种后约75天。所有幼苗都形成了发育良好的外生菌根t .日本松茸接种后4个月无微生物污染(图1）.未接种的对照苗和赤霉病菌根均未发现外生菌根。菌根根尖ITS序列p . elliottii(基因库acc。MF521937)和p . armandii(基因库acc。MF521899)显示出100%的同一性t .日本松茸YN₁压力。

菌根的形态解剖特征

形态上的外生菌根t .日本松茸与p . elliottii（图1一个和1 b)对p . armandii（图1 e和图1 f）.但是，外生菌根的形成p . elliottii与之相比更早更丰富p . armandii．这两个p . elliottii和p . armandii苗接种t .日本松茸有许多肿胀和二分的侧根，根轴上白色的根尖部分被根外菌丝体覆盖(图1 b和图1 f）.基生菌根根部皮层的炭化是典型的t .日本松茸花岗岩基土壤中的菌根在体外［25)，没有被观察到。植物外生菌根的解剖特征p . elliottii（图1 d)与……非常相似p . armandii（图1 h）.侧根处Hartig网持续发育，真菌鞘壁略厚。

讨论

“驯服”t .日本松茸由于其巨大的经济和生态价值，商业种植一直是人们的梦想。然而，尽管已经做出了许多努力，但几乎所有的尝试都失败了，部分原因是缺乏对其遗传特征的认识和理解共生与寄主植物的分子相互作用。在JGI菌根基因组学计划的框架内，基因组信息t .日本松茸(http://genome.jgi.doe.gov/Trima3/Trima3.home.html)，这将加快有关t .日本松茸生物学和光明的道路，人工栽培。

尝试培养t .日本松茸始于二十世纪初的日本[13]。尽管技术挑战很大，但日本研究人员已经取得了相当大的进展。最初的成功包括孢子的发芽[16]，获得纯培养菌丝，合成外生菌根在体外［26]，以及在含花岗岩基土壤基质的开罐栽培系统中人工形成shiro [25]，而不能生产子实体或人工合成菌根建立种植园幼苗．在中国直到现在，仍然没有正式的报道t .日本松茸无菌条件下菌根的合成在体外．其主要难点在于从子实体中分离纯培养菌丝体相对困难，菌丝体生长非常缓慢在体外［26]。利用改良的Pachlewski培养基，成功地从中国西南混交林采集的子实体组织中获得了纯培养菌丝。根据ITS序列分析，该分离株与来自日本和芬兰的另外两株分离株没有任何差异。为克服菌丝生长速度慢的缺点，采用液体培养的菌丝作为接种体，与固体接种体相比，液体培养的菌丝生长得更好，而且易于操作。

高效菌根的形成在体外很大程度上取决于栽培系统。对于快速生长的植物苗木真菌，开罐栽培系统是获得外生菌根集约化幼苗的有效方法。在这个系统中，温室中甚至有几个物种产生外生菌根蘑菇，包括Cantharellus cibarius [27]、预示性口蘑、皂角口蘑及皂角口蘑[28]。但是，这种常规的菌根建立方法不适用于t .日本松茸．芬兰的一个研究小组利用一个装有琼脂斜坡和粘土珠的无菌试管系统，成功地合成了菌根幼苗[10]。尽管该系统具有明显的优势，但似乎耗时，而且处理容易破坏菌根结构。在这里，我们使用改良的纯培养琼脂平板系统[22]，使用方便，证明用汉语进行菌根形成是有效的t .日本松茸隔离。平板上的定植苗是否能在开放式花盆或苗圃中适应，这将是一个有趣的决定。

除了栽培系统，寄主的特异性，这需要最佳组合的寄主植物种类和t .日本松茸隔离(29]，是菌根合成中需要考虑的另一个重要因素在体外．据报道，本地树种与本地树种的相容性较好t .日本松茸［10]。但本研究结果明确表明，外来树种p . elliottii似乎更多传染性而不是本土的树p . armandii由中国t .日本松茸菌根的形态解剖特征无显著差异(图1）.p . elliottii源自美国[18]可能是在20世纪40年代末传入中国的[19),而p . armandii是自然宿主吗t .日本松茸在中国西南部[13]。这两个p . elliottii和p . armandii是具有重要经济价值的树种，在中国中部和西南部广泛种植。奇异松菌根高效合成方法的发现p . elliottii与中国t .日本松茸孤立提出了关于起源和进化的问题t .日本松茸在中国的物种。t .日本松茸的迁徙而来t .日本松茸从北美穿过白令海峡[1]。如果是这样的话，它将部分解释的关联p . elliottii与中国t .日本松茸隔离(30.]。

综上所述，这是第一次详细报道的合成菌根t .日本松茸从中国分离出来，由两种重要的商业树木组成，p . elliottii和p . armandii［31]。这一发现对潜力具有实际意义t .日本松茸培养未来。

确认

中央高校基本科研业务费专项资金项目(No. 2662015PY058)和华中农业大学科技自主创新基金项目(No. 2662014BQ016)资助。

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