真菌的形成在体外的松果体elliottii和松果体armandii与松茸隔离从中国西南部

文摘

松茸是一种食用真菌蘑菇(ECM)高的生态和经济价值。的菌根体外合成与t .日本松茸隔离来自日本和芬兰已经详细调查和广泛报道。然而,到目前为止没有合成菌根的形态和解剖特征的详细描述在体外t .日本松茸隔离控制的实验室条件下来自中国。在这项研究中,使用纯培养蒸机板系统,我们证明了t .日本松茸隔离从中国西南部与奇异的树可以形成成熟的ectomycorrhiza松果体elliottii和土著树松果体armandii。菌根协会包括真菌地幔鞘和成熟的Hartig网。p . elliottii是世界上广泛种植,具有重要经济价值的木材和树脂行业,而p armandii原产于中国和中国中部和西南部广泛种植。有趣的是,菌根的形成p . elliottii早些时候,更加丰富与p armandii pureculture板系统。我们的研究结果提供了一个新的视角来研究世界上t .日本松茸的培养,以及菌根的传播p elliottii和p . armandii幼苗在中国。

关键字

真菌真菌、食用菌栽培、松果体armandii,松果体elliottii,松茸

介绍

松茸(美国Ito & s Imai)歌手也称为song-rong或song-koumo在中国,是一个非常受人尊敬的,有商业价值的真菌担子菌类蘑菇。物种分布在整个北半球环北带的包括亚洲国家(日本、中国、不丹、和韩国),欧洲(芬兰、法国、意大利、瑞典、挪威、德国和瑞士),和北美1- - - - - -3]。在中国,合适的栖息地t .日本松茸主要是位于两个主要区域:中国西南地区,包括云南、四川,西藏自治区,贵州,中国东北包括黑龙江省和吉林省[4,5]。由于过度的商业收集和合适的栖息地的破坏,自然的数量t .日本松茸已经明显减少甚至灭绝在中国和日本,主要生产地区等(6]。因此自然种群的保护和管理t .日本松茸已经成为迫切的,它被列为第二类国家吗濒临灭绝的物种在中国自1999年以来,(7]。

的主要寄主植物t .日本松茸是日本红松树(赤松摘要。&调查)的森林在日本,韩国,和中国东北[8,9]。在北欧,t .日本松茸主要是与欧洲赤松松果体sylvestis和挪威云杉(l)岩溶(10]。其他宿主树木包括冷杉属veitchii和Tsuga diversifolia在日本亚高山森林11),松果体thunbergii,松果体pumila, Quercus樟子松在中国东北和朝鲜半岛(12),松属云南裂,松果体wallichiana,松果体armandii,摘要orthacantha, Quercus aquifolioides分布spp, Pasania种虫害中国西南部和不丹13,14]。除了这些自然宿主,t .日本松茸被实验证明与桦木物种桦木属platyphylla var.粳稻和安第斯Cedrela hererae(楝科)在体外(15- - - - - -17]。

广泛的宿主植物在自然界中强调寻找更好的主人关系的重要性t .日本松茸在在体外菌根合成。t .日本松茸隔离从芬兰形成菌根在本地p .抗旱性和p .冷杉属幼苗在体外,但是日本孤立没有(10]。因此,比较在体外菌根合成实验是必要的,本地或外来植物物种和组合t .日本松茸隔离来自不同地理位置。在寻找更好的寄主植物t .日本松茸隔离YN₁从中国西南部,我们发现外来削减松(松果体elliottiiEngelm)形成大量的菌根t .日本松茸YN₁克隆。p . elliottii原产于美国东南部和培育全球(18]。由于其显著的特点,包括快速增长、适应性广,和树脂含量高,它被引入中国造林在超过12个省(19,20.]。

中国协会的发现t .日本松茸隔离与异国情调的松树p . elliottii很有趣。然后我们进一步评估的殖民水平p . elliottii通过比较它与土著树松果体armandii有一个广泛的分布在中国中部和西南部[21]。本研究的目的是调查之间的关系t .日本松茸和这两个针叶树树在体外使用纯培养菌根合成蒸机板系统(22),提出了一种比较的描述这些ectomycorrhizas的形态和解剖特征。

材料和方法

真菌隔离和培养液的准备t .日本松茸

t .日本松茸YN₁从一块子实体分离得到,收集在南华县,2014年云南省,中国。纯培养的菌丝被保持在修改Pachlewski中含有酵母提取1 g, 20 g的葡萄糖,麦芽糖5克,0.5 g的酒石酸铵,1 g (KH2PO4 thiamine-HCl MgSO4.7H2O 0.5克,0.1 g, 1毫升的微量元素股票的解决方案(1 L等股票解决方案包含8.45克的H3BO3 MnSO4 5克。硫酸亚铁水,6克,ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O 0.625克,2.27 g和0.27 g (NH4) 2 moo4)每升。pH值调整到5.8在高压灭菌20分钟121°C。

8到10小裂片的菌丝体削减t .日本松茸母亲文化被转移到无菌250毫升玻璃烧瓶内包含100毫升液体改性Pachlewski媒介。1 - 2月后固定在黑暗中孵化的23°C,菌丝是用作菌根合成剂。

无菌培养植物幼苗

的种子p . elliottii和p . armandii来自湖北省林业局,中国,和守恒的4直到利用率。为发芽,他们在液氮治疗了30秒,然后用30%的过氧化氢surface-sterilized 30分钟,其次是用无菌蒸馏水洗涤数次。发芽的种子剩下1%无菌水琼脂培养基在培养皿在黑暗中23°C 6天,在3天的23°C。发芽后,幼苗无微生物污染被移植到增长/合成盘子。

对无菌接种菌根合成

菌根合成进行了在大型塑料培养皿(150毫米直径)。盘子倒了半歇工的深层介质女士(美国SIGMA-ALDRICH Murashige和斯库格1962)没有蔗糖。无菌透明膜被表面的女士中防止根系生长。年轻与无菌钳和种植幼苗被拿起板的中间的透明膜。比米斯公司,盘子用封口膜密封(USA Inc .),和较低的部分被包裹在铝箔,以防止光影响开发根系和菌根。套板被维持在一个角度约。75°生长室以恒定23°C的政权下16 h光,黑暗8 h。增长3 - 5天后,液体培养的菌丝体的培养液是应用于根系。盘子被返回到生长室。2厘米拍摄岩屑的杨树trichocarpa与节间被用作控制。

菌根的观察

菌根进行援助的立体显微镜(奥林巴斯SZX16)。横截面,假定的菌根幼苗根尖被移除,2 - 3毫米段被削减和固定在FAA固定剂(10% (v / v)甲醛,50% (v / v)绝对乙醇,5% (v / v)醋酸),并通过分级脱水乙醇系列和嵌入式使用石蜡(化学试剂国药控股有限公司,中国)。串行的部分10μm厚度通过切片机(热Microm HM360)和连接到显微镜幻灯片。通过分级部分在二甲苯脱蜡、水化乙醇系列,和沾1%红色染料溶解在50%的乙醇。其次是乙醇洗涤和随后的快速染色部分0.1%的绿色在80%丙酮。

样本在光学显微镜(日本奥林巴斯BX51)和5.0使用MicroPublisher RTV相机拍摄的图像连接到显微镜。

真菌的分子鉴定

基因组孢子果的DNA,菌丝体文化和菌根技巧是提取hexadecyltrimethylammonium溴化(CTAB)协议(23]。引物对ITS1F / ITS4(加尔省和布鲁斯1993)被用来放大内部转录间隔区(ITS)地区的基因组核糖体RNA基因(rDNA)。优化聚合酶链reacon (PCR)条件如下:94°C的4分钟,其次是35周期为30秒94°C, 56°C 30秒和60秒72°C, 72°C的最后一步没有DNA的5分钟。-控制包含在所有运行检测可能的污染。PCR产物测序,测序一个商业服务(Quintarabio有限公司,中国)相同的引物用于放大。叠连群代表共识是组装和爆炸搜索真菌序列在基因库。本研究的原始序列沉积在基因库加入数字MF521936 MF521937, MF521898 MF521899。

结果与讨论

分子分析t .日本松茸隔离从中国西南部

ITS-rDNA区域的核苷酸序列t .日本松茸YN₁隔离(基因库acc。MF521898)从中国西南部符合母公司的孢子果(基因库acc。MF521936)。其序列的t .日本松茸YN₁隔离与日本孤立AB968622 [11芬兰隔离GQ904716 []10),另一个公布了序列GU134497从中国东北24]。没有变化在其地区(642个碱基对)这些隔离(补充材料表1),因此隔离YN₁被证实是t .日本松茸。

表1:其序列的比较t .日本松茸YN₁隔离与相应的序列从基因库中检索数据库。

Mycorrhization纯培养系统

使用纯培养板系统,殖民的t .日本松茸侧根的技巧p . elliottii观察接种后约2个月,但不明显p . armandii在这个时间。明显的菌根形态开始看到在横向的根源p . armandii接种后约75天。所有幼苗形成发达的ectomycorrhizast .日本松茸无微生物污染接种后4个月(图1)。没有发现ectomycorrhiza p . trichocarpa和控制幼苗的根没有接种。其菌根根尖的序列p . elliottii(基因库acc。MF521937)和p . armandii(基因库acc。MF521899)显示,100%的身份t .日本松茸YN₁压力。

菌根的形态和解剖特征

ectomycorrhiza形态的t .日本松茸与p . elliottii(图1一个和1 b)并没有显示出显著的差异p . armandii(图1 e和图1 f)。然而,ectomycorrhiza的形成p . elliottii早些时候,更加丰富而p . armandii。这两个p . elliottii和p . armandii苗接种t .日本松茸有许多肿胀和二分横向根白色根技巧部分覆盖着extraradical菌丝在根轴(图1 b和图1 f)。皮质的碳化基底菌根的根,这是典型的t .日本松茸菌根在granite-based土壤在体外(25),没有被观察到。ectomycorrhiza的解剖特点p . elliottii(图1 d)非常类似p . armandii(图1 h)。不断开发Hartig净在观察侧根略厚壁真菌鞘。

讨论

“驯服”t .日本松茸商业种植是一个长久以来的梦想因其巨大的经济和生态价值。然而,尽管许多努力之后,几乎所有的尝试都失败的部分原因是缺乏了解其遗传特征和理解的共生分子间相互作用与寄主植物。变得菌根基因组计划的框架内,基因信息t .日本松茸目前可用的(http://genome.jgi.doe.gov/Trima3/Trima3.home.html),这将加快研究t .日本松茸光生物学和人工培养的方法。

努力培养t .日本松茸开始在日本在二十世纪的开始13]。尽管巨大的技术挑战,日本研究人员已取得相当大的进展。最初的成功包括发芽孢子(16),获得纯培养菌丝,合成ectomycorrhizas在体外(26),和人工shiro形成一个开口坩埚文化系统包含granite-based土壤基质(25),而无法产生子实体或建立种植园使用人工合成菌根幼苗。在中国直到现在,仍然没有正式的报告t .日本松茸在无菌条件下菌根合成在体外。纯培养的主要困难在于隔离菌丝从子实体是相对困难的,和菌丝体的生长速度非常慢在体外(26]。使用修改后的Pachlewski介质,纯培养菌丝从子实体组织获得成功在混合收集在中国西南的森林。根据其序列,我们没有发现任何差异这个隔离与另一个两个分离株分别来自日本和芬兰。为了克服菌丝生长速率缓慢,液体培养的菌丝被用作培养液,更好的发展,并容易操作与固体剂进行比较。

高效菌根的形成在体外在很大程度上是依赖于培养系统。快速增长的植物苗圃真菌的开口坩埚种植系统是一种有效的方法获取集装箱真菌幼苗。在此系统中,一些物种甚至产生真菌蘑菇温室,包括Cantharellus cibarius [27),缘毛portentosum,缘毛saponaceum和缘毛saponaceum [28]。然而,这个例程的方法建立菌根不适用t .日本松茸。系统使用一个无菌试管装满琼脂斜率和粘土珠子,芬兰集团成功地合成了菌根幼苗(10]。尽管有明显的优势,该系统似乎是耗时的,菌根结构容易受到处理。在这里,我们使用一个修改过的纯培养琼脂板系统(22),这是易于使用和被证明是有效的使用中国形成菌根t .日本松茸隔离。殖民幼苗在板是否可以适应在托儿所会打开锅或有趣的决定。

除了种植系统、宿主特异性,这需要宿主植物物种的最优组合t .日本松茸隔离(29日),是另一个需要考虑的重要因素在菌根合成在体外。据报道,当地树种更兼容t .日本松茸(10]。然而,这项研究的结果清楚地表明,奇异的树p . elliottii似乎更传染性比本土的树p . armandii由中国t .日本松茸隔离,尽管菌根的形态和解剖特征显示无显著差异(图1)。p . elliottii来自美国(18),可能是在1940年代末传入中国(19),而p . armandii是一种天然宿主的t .日本松茸在中国西南部13]。这两个p . elliottii和p . armandii经济上重要的树木,在中国中部和西南部广泛种植。高效菌根合成的发现的松树p . elliottii与中国t .日本松茸孤立的起源和演化问题t .日本松茸在中国的物种。t .日本松茸来自亚洲的移民t .日本松茸从北美通过白令海峡1]。如果是这样的话,它将部分解释了协会p . elliottii与中国t .日本松茸隔离(30.]。

总而言之,这是第一个合成菌根的详细报告t .日本松茸从中国分离,形成两个商业上重要的树,p . elliottii和p . armandii(31日]。这一发现将为潜在的有实际意义t .日本松茸培养在未来。

确认

这项工作得到了中央大学基础研究基金(批准号2662015 py058)和华中农业大学科学和技术自主创新基金会(项目号2662014 bq016)。

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