酒精对二硝基水杨酸测定还原糖

文摘

的决心还原糖,尤其是葡萄糖,相当大的兴趣。分析认为米勒使用3,5-dinitrosalicyclic酸(DNS)被广泛使用但患有一些限制。尽管如此,方便和IUPAC生物技术委员会推荐的测量纤维素酶活性。我们发现5 - 10%浓度的甲醇,乙醇,1 -丙胺干扰DNS化验和给予积极的错误(葡萄糖)的明显增加当水标准被用于校准分析。乙醇浓度超过15%左右,分析了负误差。在乙醇中,这是由于一个乙醇对color-forming反应的影响以及对产品的光谱吸光度轻微影响。

关键字

酒精,还原糖,葡萄糖,甲醇,乙醇,1 -丙胺,DNS化验

介绍

生物质感兴趣的是更新的有机化合物来源。最大的部分生物量与纤维素和碳水化合物半纤维素由高达60 - 70%的总生物量干重(1,2]。利用生物质经常呼吁将纤维素转化为葡萄糖,需要一个精确的量化方法中的葡萄糖反应。一个试验使用3 5-dinitrosalicyclic酸(DNS)被广泛用于量化还原糖(3,4),但也存在一些限制(5,6]。例如,DNS化验出更高的估计比高效液相色谱法(HPLC)或一个安培计的葡萄糖分析仪,在确定葡萄糖在木质纤维素的玉米胚芽蛋白酶解物,虽然高效液相色谱显示不可溶性纤维糊精高于纤维二糖(5]。DNS分析与反应的平等不给号码的摩尔数不同的糖类7),和DNS分析高估了木聚糖酶,β-mannase和β-glucanase活动(8];以及α-amylase活动(7]。大多数工人报告说,DNS比常见的替代品(试验不太敏感8,9),尽管其中一组报道,phenol-sulfuric酸和Nelson-Somogyi (NS)方法不如DNS敏感试验(10]。这些后者工人还发现磷酸妨碍了DNS化验。根据马斯登et al ., DNS化验”给出了一个快速和简单的程度的估计糖化“虽然这些工人报告说,它是由柠檬酸(受干扰11]。氨基酸也已知干扰DNS试验[特谢拉,2012][12]。尽管如此,DNS化验IUPAC生物技术委员会推荐的测量对滤纸和羧甲基纤维素(纤维素酶活动13]。

我们发现,适度的浓度甲醇,乙醇,1 -和2 -丙醇还干扰DNS化验和葡萄糖的明显增加。在乙醇中,这是由于一个乙醇对color-forming反应的影响以及对光谱吸光度略有影响的产品14]。

实验

真实3-amino-5-nitrosalicylic酸和3,5-dinitrosalicylic酸(DNS)买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州);所有其他化学物质来自费舍尔科学(宾夕法尼亚州匹兹堡)。葡萄糖的解决方案准备工作从10.0毫克/毫升水股票的解决方案。解决方案包含乙醇是由混合适当的纯酒精的体积与股票葡萄糖溶液和水一样的葡萄糖浓度的水工作标准,但含有10 - 20%的乙醇。复制20%的乙醇样本测试历时几周确认再现性。所有样品都是在室温下准备。

DNS试剂和曼德尔描述的进行了化验,除了卷是降低了10倍。因此,150μL每个样本和300μL DNS试剂在试管中,管子被置于沸水浴8分钟,然后取出,在室温下冷却10 - 15分钟。每个解决方案被稀释8.0毫升的水和混合。每种解决方案的吸光度在540 nm记录整合模型UV2100PU分光光度计(Cole-Parmer,弗农山,IL)。

评估是否影响乙醇的光谱3-amino-5-nitrosalicylic酸,复合的股票的解决方案准备在0 - 20%的乙醇0.75酒石酸钾钠。稀释浓度相当于这些DNS进行了测定和光谱记录使用u - 3900分光光度计(日立高新技术、达拉斯、TX)。

评估是否酒精影响color-forming反应,2.5毫克/毫升合适的乙醇浓度的葡萄糖溶液与DNS试剂混合,放在沸水浴15分钟,冷却和稀释水。光谱的这些解决方案使用日立u - 3900紫外可见记录分光光度计。

结果与讨论

图1显示校准曲线获得DNS测定葡萄糖的水,10%和20% (v / v)乙醇。添加乙醇造成明显的吸光度的增加,导致了高估的葡萄糖浓度。这个错误的程度变化不到1%至25%取决于真实的葡萄糖浓度和乙醇浓度。乙醇浓度8至12%的误差是高于乙醇浓度在12%以上。类似的结果使用甲醇,1 -丙胺(数据未显示)。

来源有两个明显的错误:酒精的存在可能干扰colorforming的化学反应以某种方式,或彩色的摩尔吸光系数的产品可能会受到酒精的存在。

DNS试验依赖于减少3 5-dinitrosalicylate, 3-amino-5-nitrosalicylate (ANS)由分析物还原糖(3]。图2显示了乙醇对540 nm的吸光度的影响真实的答。有轻微的吸光度下降从0 - 5%乙醇浓度增加;除此之外,吸光度增加。类似的结果通过生成ANS使用单一,DNS的大型葡萄糖反应试剂,然后稀释相同数量的适当数量的水和乙醇混合物(数据没有显示)。

仅从这些结果来看,乙醇的干扰并不奇怪。乙醇引起了俺们的摩尔吸光系数的变化可能通过改变溶剂的极性笼子里有一个关联的变化稳定的兴奋状态。然而,这不能完全解释的干扰。图2表明,俺们的摩尔吸光系数增加而增加乙醇;增加更大的超过12%乙醇(数据没有显示)。但是20%的乙醇的校准曲线获得低于10%乙醇。这表明,更高浓度的乙醇也影响DNS反应的程度。

这是数据的证实图3吸光度的比值,在540 nm DNS反应的一个固定数量的葡萄糖的吸光度ANS的定额,在不同乙醇浓度。如果俺们的摩尔吸光系数的变化产品的唯一因素,这一比率将常数。15%的乙醇的比例大约持续了;除此之外,有一个显著减少比率。对葡萄糖反应混合物样品的吸光度在20%乙醇低于相同数量的葡萄糖在低浓度的乙醇。这就解释了为什么20%的乙醇的校准曲线是低于10%的乙醇的曲线,如图所示图1。

结论

乙醇和低醇干扰DNS测定还原糖。这种干扰是由于俺们产品的摩尔吸光系数的变化,以更高的乙醇浓度,影响DNS反应本身。还原糖的测定alcohol-containing矩阵使用DNS方法会给系统错误结果的矩阵分析物的标准不匹配样本。

确认

我们感谢美国国家科学基金会的拨款0959229和IUP教务长办公室学术卓越和创新奖项支持这项工作。

引用

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