印楝甲醇提取物对伯氏疟原虫感染小鼠唾液酸谱的影响

摘要

本文研究了印楝叶和茎皮提取物对实验性感染伯氏疟原虫的白化小鼠唾液酸谱的影响。伯氏疟原虫感染白化小鼠的感染红细胞中唾液酸的含量是未感染红细胞的2 - 4倍。感染红细胞血清(游离)唾液酸值为1.45 mg/ml，未感染红细胞为0.87 mg/ml。在所有试验组中，血清唾液酸和RBC-SA在不同处理之间变化(分别为1.13-1.40和3.25-4.70 mg/ml)。与未治疗的感染小鼠的数值(分别为1.42-2.13和3.05- 3.71 mg/ ml)相比，处理样品的记录值之间存在显著差异(p≤0.05)。治疗小鼠的RBC-SA值显著低于正常(未感染)小鼠的记录值(分别为4.27和5.21 mg/ml)，但高于感染未治疗小鼠。与正常小鼠相比，治疗小鼠的血清唾液酸有所增加，这也在治疗小鼠的大脑唾液酸谱中观察到。脑唾液酸谱中记录的值高于从血清中获得的值。幸存者(治疗小鼠)的血清和脑游离唾液酸含量几乎归一化到未感染小鼠的值。使用印楝提取物治疗期间，游离唾液酸释放量减少了约30%。 The increase in the free sialic acid levels during infection, treatment and the subsequent decrease post-treatment suggested that the neem leaf and stem bark extracts possesses therapeutic efficacy and confers an advantage in ameliorating P. berghei infection which should be exploited in view of the global resistance of malaria parasites to mainstay anti-malarials.

关键字

楝树提取物，P. berghei，唾液酸，白化小鼠。

简介

疟疾是人类最重要的寄生虫病[1］．大多数疟疾死亡是由于脑并发症[2］．大多数死亡发生在非洲，特别是5岁以下儿童[3.-5］．氯喹一直是首选的一线抗疟疾药物，但对氯喹的耐药性现在广泛分布在恶性疟原虫流行的所有地理区域[6，7］．疟疾寄生虫对氯喹和其他药物的耐药性促使人们寻找具有新作用模式的化疗药物。

用草药治疗疟疾，早在西药到来之前就已经存在了。8］．迄今为止所研究的药用植物通常是根据其传统用途和在治疗疟疾和其他疾病方面的疗效而选择的。目前正在进行科学研究的少数几种植物包括尼日利亚许多地区的柠檬草、尼日利亚北部的楝树叶子和树皮以及尼日利亚南部的樱桃芒果树皮，这些植物在减少寄生虫病方面取得了积极成果[8］．

疟原虫像其他寄生虫，如锥虫，具有唾液酸酶和磷脂酶等酶系统，导致锥虫病贫血等临床症状，在疟疾中也观察到。贫血早就被确定为人类和动物疟疾的主要临床特征[9-11］．受感染动物在锥虫病急性期开始时发生血管内贫血[12]部分归因于锥虫体内的一种唾液酸酶从红细胞表面裂解唾液酸[13］．

唾液酸是一种含有9个碳原子且带负电荷的羧化糖家族。唾液酸作为细胞表面的末端糖残基，在多种生物过程中发挥着重要作用[14］．它们作为黏蛋白、细胞和液体糖蛋白、神经节苷、牛奶低聚糖和某些微生物聚合物中的低聚糖单元的组成部分广泛分布于自然界[15-17］．

人和动物的红细胞膜含有高浓度的唾液酸[18，19］．红细胞唾液酸(rbc -唾液酸)是其他细胞或化合物与细胞接触时最先遇到的分子之一。雷竞技网页版唾液酸出现在红细胞上，掩盖半乳糖残留，因为半乳糖是与唾液酸并列在细胞膜上的直接糖[14］．通过唾液酸酶的作用从微生物中去除唾液酸会导致这种细胞的破坏[20.-24］．

本研究旨在评估感染伯氏疟原虫并使用印楝甲醇提取物治疗的小鼠唾液酸谱，这可能有助于了解该提取物对关键致病酶系统的作用模式，以及它们在介导疟疾感染典型贫血条件中的可能作用

材料与方法

实验动物

无感染的白化小鼠(20-25g)，从尼日利亚扎里亚的Ahmadu Bello大学药理学和临床药学系的动物室设施中获得。在通风良好、温度为25±1°C的室内饲养一周，随意喂食优质饲料和水。

寄生虫应变

疟疾寄生虫(伯氏疟原虫)由以色列耶路撒冷埃因克伦希伯来大学Kuvin医学中心的A.J Nok教授(MFR)获得。在本研究中，该菌株在实验室中通过小鼠之间的连续血液传代来维持。

工厂收集

印楝(Neem)茎皮、种子和叶子采集自扎里亚国家化学技术研究所，在扎里亚Ahmadu Bello大学生物科学系植物标本室鉴定为Azadirachta indica A. Juss，证号900151。

实验程序

甲醇提取物的制备

茎皮和叶子被切成小块并在实验室中干燥，收集干燥的种子，进行加工，并去除内核。将各自的样品研磨成细粉，每个样品100克用500毫升甲醇提取，在室温下在摇轨器中放置72小时。不同的提取物在旋转蒸发器的真空下过滤和浓缩。提取物保存在密封瓶中，4摄氏度在冰箱中直到使用。

小鼠接种及寄生虫计数

取寄生血症上升20%的供体小鼠，用肝素化注射器采集血液，用磷酸盐缓冲盐水稀释至108个寄生红细胞/ml。小鼠感染是由伯氏疟原虫制剂从供体小鼠通过腹腔内途径针传至健康测试小鼠而引起的[25］．每只小鼠接受0.2 ml (2 × 107寄生红细胞)稀释感染全血。采用显微吉氏染色薄血涂片监测寄生虫血症。在十个这样的区域中，每一个被寄生的红细胞数量都被计数三次，并计算平均值以得出每只小鼠的寄生虫血症水平[25，26］．

印楝提取物功效的初步生物学评估:

选用32只小鼠，分为A、B、C、D、E、F、G、H组，每组4只。除H组为正常对照组外，每只小鼠腹腔注射0.2ml稀释感染血(108个寄生红细胞/ml) [25，27］．

实验A组至F组小鼠在感染后2小时开始以10mg/kg体重的剂量治疗，每天重复同样的剂量，持续72小时。楝树提取物溶解于二甲基亚砜(DMSO)和13%乙醇中。

A组-对照组(未经治疗感染)

B组-用氯喹(CHQ)治疗(10mg/kg)

C组- Artheeter (ATM)处理(10mg/kg)

D组-奎宁(QUI)治疗(10mg/kg)

E组-印楝叶提取物(NLE)处理(10mg/kg)

F组-印楝茎皮提取物(NBE)处理(10mg/kg)

G组-印楝籽提取物(NSE)处理(10mg/kg)

H组-未感染(正常对照组用DMSO治疗)

最后一次治疗后24小时(感染后96小时)，制备所有动物的血液涂片，用吉姆萨染色。在显微镜下计数10个区域，每个区域约有100个红细胞，以确定寄生虫血症水平。计算实验组的平均值之间的差值，并表示为对寄生虫病抑制的百分比，使用以下公式:

红细胞鬼影法测定唾液酸谱的制备

幽灵细胞的制备方法如Dodge等人先前所述[28]和唾液酸谱的测定采用高碘酸硫代巴比妥酸(TBA)法测定游离唾液酸氨基off [29］．采用TBA法测定采集血清样品中的游离唾液酸浓度[30.］．

用100 μl血清与20 μl 0.1 M HCl孵育3小时，使结合唾液酸释放，测定血清中的结合唾液酸浓度。定量后的唾液酸称为总唾液酸([SA] T)，总唾液酸与游离唾液酸之间的差值表示结合的唾液酸。

[sa] t = [sa] b + [sa] f。

红细胞表面唾液酸(RBC-SA)

红细胞上唾液酸的测定如前所述。用100 μl 0.1 M HCl在80℃下孵育1小时，以释放膜结合唾液酸[31］．采用TBA法测定游离唾液酸的浓度。

结果与讨论

楝树提取物抗疟疾筛选

分别用10毫克/公斤/天(i.p)三种不同楝树提取物(叶子、茎皮和籽仁)治疗的小鼠组，与未治疗的感染小鼠相比，寄生虫血症发作次数较低(数字．1而且b)表明印楝提取物对伯氏疟原虫具有显著的抗疟活性。茎皮提取物对抑制寄生虫血症最有效。然而，楝树种子提取物毒性很大，治疗后6天内小鼠死亡。印楝茎皮和印楝叶提取物分别减少了约55.83%和50.74%的寄生虫血症(图1)．

标准药物中，阿托米(ATM)、奎宁(QUI)和氯喹(CHQ)分别占85.49%、73.39%和29.85%。由于寄生虫对氯喹的固有耐药性，氯喹不能像其他标准抗疟药一样抑制寄生虫血症。

关键字:NLE-印楝叶提取物、NBE -印楝茎皮提取物、NSE-印楝籽提取物、ATM-青蒿素、QUI-奎宁和chq -氯喹

此外，随着感染的进展，我们观察到感染小鼠血清中游离唾液酸水平的增加(图2)．这也与感染期间观察到的PCV谱减少相对应(图3)．

红细胞表面唾液酸(RBC-SA)在不同水平的寄生虫血症中均呈逐渐降低的趋势(图4)．感染期间血清结合唾液酸水平无显著性差异(p<0.05)，结合唾液酸呈逐渐下降趋势(图5)．

在所有实验组中，血清游离唾液酸和RBC-SA在不同的治疗中有所不同(图6而且图7)与受感染的未受治疗的小鼠相比，受治疗样本的记录值之间存在显著差异(p≤0.05)(图6而且图7)．治疗小鼠的RBC-SA(来自鬼影细胞的红细胞唾液酸)值明显低于正常(未感染)小鼠的记录值图7)，但与未接受治疗的受感染小鼠相比更高。

与正常小鼠相比，治疗小鼠的游离血清唾液酸也有所增加(图6)．在治疗小鼠的脑匀浆的唾液酸谱中也获得了类似的数据(图8)．脑匀浆中记录的值高于从血清样本中获得的值。生存者的血清游离唾液酸几乎恢复正常(图9)，除氯喹处理小鼠的数值显著高于实验对照组(p≤0.05)外。

从糖残基和糖蛋白中分离的终端唾液酸由酶裂解而成，唾液酸酶的检测依赖于从底物中分离的游离唾液酸的测定[32］．本研究观察到伯氏疟原虫(ANKA株)在体外能产生唾液酸酶。游离血清唾液酸水平升高，结合血清唾液酸水平略有下降，红细胞表面唾液酸明显下降，说明红细胞是释放唾液酸的主要来源。

充血细胞体积减少，这是贫血的一个指标[31]在伯氏疟原虫感染小鼠中观察到。PCV的减少与rbc -唾液酸的减少相对应，据报道，红细胞吞噬增多和红细胞半衰期缩短在一定程度上导致贫血[23，33-35］．

高寄生虫血症小鼠血清游离唾液酸非常高。已知唾液酸酶可从受感染动物的红细胞中分离唾液酸[36，31］．这种裂解可以解释为什么感染动物的血清游离唾液酸很高，而红细胞表面唾液酸相对较低。

结论

在初步抗疟评估中，楝树茎皮和叶子的提取物分别抑制了55.83%和50.74%的寄生虫血症，而且，用这种植物提取物治疗的净效果是唾液酸谱的正常化，这进一步暗示了对唾液酸酶的潜在作用。

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