UV-B辐射对普通小球藻生长、光合活性和代谢活性的影响

摘要

不同强度(1 Wm^－２3 . Wm^－２和5个小时^－２研究了紫外线b (UV-B)辐射对生长、光合色素和代谢活性的影响小球藻寻常的从Chengalpet Kulavoi湖淡水样本中分离得到。实验藻类小球藻寻常的暴露于不同强度的1,3,5 W m^－２，以及10、15、20、25、30分钟的UV-B辐射时间。在不同的处理强度和持续时间中，叶绿素5 Wm的抑制率为50%^－２15分钟后，细胞生长下降。另一方面，类胡萝卜素在小剂量(暴露时间和强度)下受到3或5 W m的刺激^－２UV-B辐射总蛋白质和总碳水化合物均受UV-B照射时间的抑制，但5wm的影响较小^－２比其他两种强度都要高。研究结果表明小球藻寻常的在较短的照射时间内，即使在较高的照射强度下，微藻也能抵抗UV-B辐射的损伤，而额外的UV-B辐射对微藻生长可能产生的负面影响可能已经通过增加吸收紫外线的化合物而被UV-B辐射胁迫有效地平衡了。

关键字

小球藻寻常的光合色素，生存，紫外线B

介绍

平流层臭氧层的减少使更多的UV-B辐射能够到达地球表面和海洋的很大深度[1]。印度是靠近赤道的国家之一，因此与阳光一起面临高通量的紫外线辐射。印度的平均纬度为赤道以北20°C，紫外线- b (UV-B;在晴朗晴朗的天空下，赤道附近(太阳仰角<25°C)的辐照度约为2.5 Wm^－２，这可能会影响该国的主要占领，即农业。位于印度北部的许多站点的总臭氧柱(TOC)的下降趋势是非常令人震惊的[signiï Ã Â]。2]。21 .基于情景的化学-气候模型^圣世纪，由于温室气体浓度高，紫外线- b辐射会增强[3.]。微藻是单细胞自养生物，生长需要阳光，在自然栖息地暴露于高水平的紫外线辐射下，同时在长期驯化过程中建立了减轻UV- b损害效应的机制。UV-B辐射对微藻的有害影响通常是由活性氧(ROS)诱导的氧化菌株介入的[4]。

藻类中最重要的过程细胞是光合作用。也有人认为UV-B辐射主要攻击光系统II和光合活性[5]。UV-B辐射通过诱导光吸收色素的光降解，导致光合能力的丧失，从而影响藻类细胞中的色素浓度[6]。因为紫外线辐射会被生物分子吸收，包括核酸、蛋白质、脂质碳水化合物对细胞内的生物和生理活动至关重要，它可以影响许多生物过程[7]。尽管太阳紫外线辐射有不利影响，但蓝藻并非毫无防备，它们已发展出各种策略，例如形成抗氧化剂或有效的DNA修复机制，以抵消紫外线- b辐射的破坏性影响[8]。

紫外光筛选化合物，如类真菌菌素氨基酸(MAAs)通常积聚在蓝细菌的细胞内。与对照相比，在20分钟/天的紫外线照射下，黄貂草诱导的MAAs是对照的3倍。9]。据报道，UV-B辐射不仅损害蓝藻的运动和光取向，而且影响许多生理生化过程，如生长、存活、色素沉着和氮新陈代谢［10]。研究表明，暴露于轻微剂量的UV-B辐射已引起某些微藻产生耐药性。微藻抗UV-B辐射有潜力作为生物柴油、抗氧化剂和营养保健品的来源。这种诱导抗UV-B的作用影响了生物柴油生产分子合成的碳捕获和碳分配效率[11]。

本研究的目的是研究绿藻的应激反应小球藻寻常的从Chengalpet Kulavoi湖的淡水样本中分离出细胞，在实验室条件下，将其暴露在三种不同强度的UV-B辐射下不同时间。同时研究了UV-B辐照对色素含量、碳水化合物、蛋白质和脂肪含量的直接影响。

材料与方法

生长条件

c .寻常的从Chengalpet Kulavoi湖的淡水样品中分离得到，并使用标准手册进行鉴定。通过继代培养、抗生素处理和紫外线照射对细菌进行纯化[12]。的文化生长并保持在30 μE^－２年代¹光照强度，12/12明暗循环和24±1°C。在600 nm处对光密度为0.15 - 0.20的对数相培养物进行UV-B照射。

UV-B辐射的方式和来源:

在液体培养基中生长的受试生物被转移到一个消毒的培养皿中，并单独暴露在人工UV-B辐射下。UV-B辐射包括三个紫外长灯阵列，UV-B灯- 280/320 nm, Philips TL 20 W/12, Philips Gleolampenfabriken，美国。在辐照过程中，悬浮液被轻轻搅拌，以促进均匀暴露。

生长速率的测量

本试验对50%的藻类种群进行致死剂量(LD50)评价。藻类细胞暴露于1 Wm^－２3 . Wm^－２和5个小时^－２每隔一段时间取出UV-B辐射，然后用Neubauer室计算其存活时间[13]。

色素的测定

取5 mL培养样，5000 rpm离心10 min，弃上清。然后将藻类颗粒加入5ml 80%的丙酮，并在超声器中均质。然后用黑纸覆盖，在4°C下保存一夜。取上清液，在Ultraspec紫外可见分光光度计644.8 λ、661.6 λ和470 λ下测定光密度[14]。

总蛋白的提取与估算

取5 mL藻类样品，5000 rpm离心15分钟。将颗粒在5ml pH 7.0的0.1 M磷酸钠缓冲液中均质，然后在超声仪中以5000 rpm离心15分钟。取上清液测定总蛋白。取0.2 mL样品蛋白5 mL CBB试剂(100 mg CBBG-250溶解于50 mL 93%乙醇中)。加入100毫升85%磷酸，用玻璃蒸馏水稀释至1000毫升，混合均匀。用空白试剂在595 nm处读取吸光度。用标准图计算蛋白量，BSA范围为10 ~ 100 μg mL¹［15]。

总碳水化合物的提取与估算

取5 mL海藻培养液，5000 rpm离心15分钟。用5 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液(pH为6.8)在超声仪中均质，然后以5000 rpm离心10分钟。收集上清液用于估算碳水化合物。1毫升样品1毫升5%苯酚和5毫升H₂所以₄加入并充分混合。溶液在室温下静置30分钟。在490 nm处读取光密度。用10 ~ 100 μg.mL不同浓度的d -葡萄糖制备标准图¹［16]。

总脂质的提取与测定

取5 mL培养物，以5000 rpm离心15分钟。用6ml氯仿:甲醇(2:1)在超声仪中均质。然后将其转移到分离漏斗中，加入2 mL 0.9% NaCl溶液混合均匀。这种混合物被静置过夜。然后从下氯仿相中取0.5 mL于干净的小瓶中，收集微球。在球团中加入浓硫酸0.5 mL，混合均匀。用玻璃球封闭试管，在沸水浴中保存10分钟，并在室温下冷却。在0.2 mL样品中加入5 mL香兰素试剂(0.2 g香兰素溶于80 mL邻苯二甲酸和20 mL蒸馏水中)，混合均匀。静置30分钟，在520nm处读出显影颜色。用5.0 ~ 50 μg/mL范围内的胆固醇制作标准图，以μg.mL表示¹［17]。

UV-B吸收化合物maa -类菌素氨基酸的提取

取30克适应UV-B的A. platensis生物量，用30%甲醇研磨，在4°C下放置过夜。提取是我¬‚ltrated通过我¬‚lters纸(绘画纸1号)和我¬‚ltrate在5000转离心20分钟在4°C。上清液采用膜过滤装置真空-ï¬Ã¬Â过滤。将ï´Ã´Â´浓缩液浓缩至300 mL。在4℃下，7000 rpm离心10 min，除去甲醇不溶性部分，将上清液浓缩，用100%甲醇悬浮。在4°C下21,000 rpm离心10 min后，得到粗MAA上清。

统计分析

结果以三个不同读数的平均值和标准差(SD)表示。采用SPSS 21.0进行统计分析，采用双方差分析(ANOVA)进行统计学分析，确定处理间的显著性程度。

结果

实验生物体小球藻寻常的从Chengalpet Kulavoi湖的淡水样本中分离得到。在30 μE m下，在低于25±1°C的Bold Basal培养基中保持培养^－２授予了¹光强及12/12明暗光周期(图1)。在本研究中，紫外光- B诱导了紫花苜蓿的生长、色素和蛋白质含量的变化小球藻寻常的进行了研究。试验生物体暴露于紫外线辐射(UV-B)的不同时间间隔为10、15、30、45和60分钟。分析了UV-B处理后幼苗生长、色素和蛋白质含量的变化。观察了试验种的生长特性小球藻寻常的与对照(未经处理的培养物)相比，随着UV-B辐射暴露时间的逐渐增加而减少。在5w m中，生长保持静态长达15分钟^－２UV-B暴露时间，随后的60分钟UV-B暴露时间下降(图2)。

生存

为了选择致死剂量(LD50)，培养c .寻常的暴露于1,3和5wm^－２不同时段的紫外线辐射，例如10、15、30、45及60分钟(表1)。5 Wm时存活率为50%^－２因此，在所有进一步的实验中都使用了该剂量。

表1:基于不同时期UV-B处理后菌落计数的存活率。

颜料

UV-B对光合色素、叶绿素和类胡萝卜素含量的影响随暴露时间的延长呈下降趋势。然而，类胡萝卜素受到的影响小于总叶绿素。与对照相比，叶绿素含量在所有紫外照射时间间隔内都有所下降，但在5 W m照射30分钟后，叶绿素含量显著增加^－２UV-B辐射在生长15天后下降。结果表明，即使在UV - B暴露时间最长的情况下(30分钟)，叶绿素含量也远高于对照(图3)。

类胡萝卜素含量

关于UV-B暴露后的类胡萝卜素含量，可以观察到，在暴露于3wm的细胞中^－２在所有暴露时间间隔内，UV-B都能增强类胡萝卜素的产生。处理10、15、30、45和60 min后，与对照相比，类胡萝卜素含量分别增加了6.5%、13.3%、30.5%、26.6%和21.7%。同样，在暴露于5w的细胞中^－２UV-B辐射最初促进了类胡萝卜素的产生然而，与对照组相比，暴露60分钟后，类胡萝卜素含量下降了15.5% (图4)。

总蛋白

紫外线b暴露导致总蛋白质的减少。在第3和第5个Wm时，60分钟后，减少率分别比对照组低86.7%和53.9%^－２,分别。暴露于3和5 Wm^－２除1 W m外，UV-B对总可溶性蛋白均有显著影响^－２/ 30min对总蛋白(图5)。

总碳水化合物

暴露的c .寻常的UV-B辐射下，总碳水化合物含量下降。经过60分钟的UV-B照射，细胞暴露于3和5 Wm^－２与对照组相比，碳水化合物含量分别下降29.0%和64.0% (图6)。

总脂质

在小球藻寻常的，对照组(无紫外线照射)总脂质含量为138 mg/L，而15分钟后为5 W / m^－２暴露于紫外线B后，脂质含量随之下降(图7)。

对暴露于UV-B辐射下的实验微藻进行了MAA (Mycosporine like amininoacids)等通常在细胞内积累的化合物的筛选。MAAs是众所周知的紫外线吸收/屏蔽化合物，提供对UV-B辐射的光防护。紫外- b处理藻类的分光光度分析显示存在MAA化合物。进一步的研究也将用于UV-B筛选化合物的定性筛选。本研究在332 nm处发现了MAAs的紫外吸收带小球藻寻常的（图8)。

讨论

到达地球表面的太阳UV-B辐射对生态系统产生了显著的变化。UV-B对微藻的不利影响也是其形成的基础食物水生系统中的链[18]。在高等植物中发现，UV-B辐射胁迫对微藻的有害影响包括抑制光合作用、破坏DNA [19]，蛋白质和脂质[19]，产生氧自由基[20.]和营养吸收的抑制[21]。UV-B诱导两种藻类细胞的结构变化[22]。在本研究中，结果表明UV-B对鱼的生长和存活有明显的抑制作用小球藻寻常的，抑制作用随UV-B照射强度和照射时间的增加而增强。与我们的研究结果一致，模拟UV-B辐射在3 ~ 5 Wm辐照度范围内的有害影响^－２在几种藻类[23]。

还清楚地表明，在5 Wm的UV-B照射下^－２叶绿素a和b含量显著降低小球藻寻常的。然而，5wm的效果^－２比3wm^－２UV-B辐射这些结果与在Ulva上得到的结果一致[24，25]。UV-B暴露可引起光合色素的损失，并减少其表达基因参与光合作用[26]。在各种生理过程中，光合作用可能是紫外线辐射的主要目标，因为可能产生多种影响[27]。UV-B对光合色素的破坏作用可能是由于UV-B照射引起的脱色，也可能是由于对光合色素的破坏酶参与叶绿素生物合成[17]。

结果表明，小剂量的UV-B辐射刺激细胞外碳水化合物的合成小球藻寻常的。然而，高剂量抑制细胞外碳水化合物的产生。先前的结果与UV-B照射对褐藻胞外多糖产生影响的研究结果一致[j]。28]。

结果还表明，1、3、5 W m的UV-B辐照^－２)显著增加了低剂量的类胡萝卜素，这与在紫外线范围内合成吸收波长的色素是藻类细胞对抗紫外线辐射的重要保护机制的报告相似[29-31]。其中包括真菌孢素样氨基酸(MAAs)，它们主要存在于细胞的外围，从而阻止UV- B辐射进一步渗透到细胞中。

MAAs是环己酮的亚胺羰基衍生物的水溶性小分子，最大吸收波长在280 ~ 360 nm之间。胞浆蛋白是一种不溶于水的分子，存在于蓝藻细胞周围的细胞外黏液鞘中，也被认为是一种光保护化合物[32]。在阿根廷海域发生甲藻赤潮时，也发现了大量和多样的MAAs。同样地，在裸子草中，毛毛也显示出来在活的有机体内和在体外紫外区的吸收，在334 nm处达到最大值，与本研究相似[33]。

结论

这表明微藻已经进化出了保护自己免受UV-B损伤的方法——要么是通过产生筛选化合物，要么是通过产生筛选化合物小球藻寻常的。具有商业意义的微藻对UV-B辐射的抗性小球藻寻常的它们有可能成为生物柴油的来源。考虑到国际油价的暴涨，有必要评估藻类作为生物柴油的能源生产潜力。这种藻类合成生物柴油分子的碳分配仍有待探索。

致谢

作者感谢印度政府科技部为本研究提供的资金支持。

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