UV-B辐射对小球藻生长、光合活性和代谢活性的影响

摘要

不同强度的影响(1 Wm^－2， 3 Wm^－2和5 Wm^－2研究了紫外线b (UV-B)辐射对植物生长、光合色素和代谢活性的影响小球藻寻常的从Chengalpet Kulavoi湖淡水样品中分离得到。实验藻类小球藻寻常的暴露在不同强度的1、3和5 W m^－2，以及分别接受10、15、20、25、30分钟的UV-B辐射。在不同强度和持续时间的试验中，50%的叶绿素5 Wm抑制了生长^－2UV-B在15分钟后减少，随后细胞生长减少。另一方面，类胡萝卜素在3或5 W m的小剂量(暴露时间和强度)下受到刺激^－2UV-B辐射。然而，总蛋白质和总碳水化合物受UV-B暴露时间的抑制，但5 Wm的影响较小^－2比其他两种强度都要大。结果表明，小球藻寻常的在较短的暴露时间内，即使在较强的暴露强度下，微藻也能抵抗UV-B辐射的损害，而额外的UV-B辐射对微藻生长可能产生的负面影响可能已被UV-B辐射压力通过增加UV-B吸收化合物而有效平衡。

关键字

小球藻寻常的，光合色素，生存，紫外线B

简介

平流层臭氧层的减少使更多的UV-B辐射到达地球表面和海洋深处[1］．印度是靠近赤道的国家之一，因此面临着高通量的紫外线辐射。印度的平均纬度在赤道以北20°C，最大紫外线- b (UV-B;在晴朗晴朗的天空下，赤道附近(太阳仰角<25°C)的辐照度约为2.5 Wm^－2，这可能会影响该国的主要占领，即农业．印度北部许多监测站的总臭氧柱(TOC)下降趋势令人高度警惕[signiï¬Ã Â]2］．基于场景的化学气候模型显示在21^圣世纪，由于温室气体浓度高，UV-B辐射将会增强[3.］．微藻是单细胞自养生物，生长需要阳光，在自然栖息地暴露在高水平的紫外线辐射下，同时，在长期的驯化过程中，研究人员开发了减少UV- b损害影响的机制。UV-B辐射对微藻的有害影响总是受到活性氧(ROS)的干扰，活性氧引起氧化应变[4］．

藻类中最重要的过程细胞就是光合作用。此外，UV-B辐射主要攻击光系统II和光合活性[5］．UV-B辐射会导致吸收光的色素在光下降解，从而影响藻类细胞内的色素浓度，导致光合作用能力丧失[6］．因为紫外线辐射会被生物分子吸收，包括核酸、蛋白质、脂质碳水化合物对细胞内的生物和生理活动至关重要，它可以影响许多生物过程[7］．尽管受到太阳紫外线辐射的不利影响，但蓝藻并非毫无防御能力，并发展出各种策略，如形成抗氧化剂或有效的DNA修复机制，以抵消紫外线- b辐射的破坏性影响[8］．

紫外光屏蔽化合物，如真菌素样氨基酸(MAAs)通常在蓝藻细胞内积累。与对照相比，在20分钟/天的紫外线照射下，受精金丝桃(Aulosira fertilissima)诱导了3倍的MAAs [9］．据报道，UV-B辐射不仅损害蓝藻的运动性和光定向，而且影响许多生理和生化过程，如生长、生存、色素沉着和氮新陈代谢［10］．研究表明，暴露在温和剂量的UV-B辐射下会诱导一些微藻产生抗药性。UV-B辐射诱导的微藻抗性有可能作为生物柴油、抗氧化剂和营养物质的来源。这种诱导的UV-B抗性影响了生物柴油生产分子合成的碳捕获和碳分配效率[11］．

这项工作的目的是研究绿藻的应激反应小球藻寻常的这是从Chengalpet Kulavoi湖的淡水样本中分离出来的细胞，在实验室条件下，在不同的时间内暴露在三种不同强度的UV-B辐射下。还研究了UV-B照射后对色素含量、碳水化合物、蛋白质和脂肪含量的影响。

材料与方法

生长条件

c .寻常的分离自成阿尔佩特库拉沃伊湖淡水样品，采用标准手册进行鉴定。通过传代培养、抗生素处理和紫外线照射对生物体进行纯化[12］．的文化生长并保持在30 μE m^－2年代^－1光照强度，12/12明暗循环，在24±1°C。在600 nm处进行UV-B照射，记录光密度为0.15 - 0.20的相培养物。

UV-B辐射的模式及来源:

在液体培养中生长的被测试的生物体被传输到一个消毒的培养皿中，并单独暴露在人工UV-B辐射下。UV-B辐射由三个紫外长灯阵列组成，UV-B灯- 280/320 nm，飞利浦TL 20 W/12，飞利浦Gleolampenfabriken，美国。在辐照过程中轻轻搅动悬浮液，以促进均匀曝光。

增长率的测量

本实验的目的是评价导致50%藻类种群死亡的致死剂量(LD50)。暴露于1 Wm的藻类细胞^－2， 3 Wm^－2和5 Wm^－2每隔一段时间提取UV-B辐射，然后用纽鲍尔室计算它们的生存时间[13］．

色素的测定

取培养样品5ml，以5000转/分离心10分钟，弃上清。然后加入5 mL 80%的丙酮，在超声波器中均质。然后盖上黑纸，放在4°C下过夜。在5000rpm下离心15分钟，收集上清液，用Ultraspec紫外可见分光光度计测定644.8 λ、661.6 λ和470 λ的光密度[14］．

总蛋白的提取与估计

取5 mL海藻样品，以5000转/分的速度离心15分钟。在超声波仪中，将颗粒在5 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液中均质，pH值为7.0，然后在5000 rpm下离心15分钟。取上清液测定总蛋白含量。取0.2 mL样品蛋白5 mL CBB试剂(100 mg CBBG-250溶解于50 mL 93%乙醇中。加入100毫升85%磷酸，用玻璃蒸馏水稀释至1000毫升，混合均匀。在595 nm处对空白试剂进行吸光度测定。采用标准图计算蛋白含量，BSA范围为10 ~ 100 μg mL^－1［15］．

总碳水化合物的提取与估算

取5 mL海藻培养物，以5000转/分的速度离心15分钟。用5 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液(pH值6.8)在超声器中均质，然后在5000 rpm下离心10分钟。收集上清用于碳水化合物的估计。取1ml样品，1ml 5%苯酚，5ml H₂所以₄加入并充分混合。溶液在室温下放置30分钟。光密度在490 nm处读取。用不同浓度的d -葡萄糖(10 ~ 100 μg.mL)制备标准图^－1［16］．

总脂质的提取与测定

取5 mL培养物，以5000转/分的速度离心15分钟。将颗粒与6 mL氯仿:甲醇(2:1)在超声器中均质。然后转移到分离漏斗中，加入2 mL 0.9% NaCl溶液，混合均匀。把这种混合物静置一夜。然后从低氯仿阶段开始，在一个干净的小瓶中收集0.5 mL并收集颗粒。向颗粒中加入0.5 mL浓硫酸并混合均匀。将玻璃弹珠放在沸水浴中10分钟，然后在室温下冷却。在0.2 mL样品中加入5 mL香兰素试剂(0.2 g香兰素溶于80 mL正磷酸和20 mL蒸馏水)，混合均匀。静置30分钟，在520nm下读取显影的颜色。标准图以5.0 ~ 50 μg/mL为基准，以μg.mL表示^－1［17］．

UV-B吸收化合物maa -类菌素氨基酸的提取

取30克UV-B适应的紫荆生物量，用30%甲醇研磨，在4℃下过夜。提取液为ï à Â通过ï à  lters纸(Whatman No. 1)， ï à  ltrate在4℃下以5000转/分离心20分钟。上清采用真空-ï à Â，使用膜过滤装置进行过滤。将ï¬Ã Â浓缩液浓缩至300 mL。在4℃下以7000转/分离心10分钟去除甲醇不溶部分，将上清液浓缩并与100%甲醇悬浮。在21,000 rpm下离心10 min, 4°C，得到上清液为粗MAA。

统计分析

结果以三个不同读数的平均值和标准差(SD)表示。采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，所得数据进行统计学分析，以确定各处理之间的显著性程度，采用双向方差分析(ANOVA)。

结果

实验生物小球藻寻常的是从Chengalpet Kulavoi湖的淡水样本中分离出来的。在Bold basic培养基中培养，温度低于25±1°C，温度为30 μE m^－2授予了^－1光强及12/12明暗光周期(图1)．在本研究中，紫外光- B诱导了紫菀的生长、色素和蛋白质含量的变化小球藻寻常的进行了研究。测试生物体暴露于不同时间间隔的紫外线辐射(UV-B)，分别为10、15、30、45和60分钟。在UV-B处理后不久，分析了生长、色素和蛋白质含量的变化。观察了试验树种的生长特征小球藻寻常的与对照组(未经处理的培养物)相比，随着暴露于UV-B辐射时间的逐渐增加而减少。生长在5 W m内保持静止15分钟^－2紫外线- b照射时间随其后60分钟紫外线- b照射时间的减少而下降(图2)．

生存

为了选择致死剂量(LD50)，培养c .寻常的暴露在1,3,5 Wm^－2不同时段(例如10、15、30、45及60分钟)的紫外线b辐射(表1)．5 Wm时生存率为50%^－2因此，在所有进一步的实验中都使用了该剂量。

表1:根据不同时期UV-B处理后的菌落计数计算存活率。

颜料

UV-B对光合色素叶绿素和类胡萝卜素含量的影响随UV-B照射时间的延长呈下降趋势。然而，类胡萝卜素受到的影响小于总叶绿素。与对照相比，叶绿素含量在所有紫外线暴露时间间隔内都有所下降，但在5 W m的暴露时间长达30分钟时，叶绿素含量显著增加^－2UV-B辐射在生长15天后下降。观察到，即使在最高的UV - B曝光时间(30分钟)，叶绿素含量也远高于对照(图3)．

类胡萝卜素含量

关于UV-B暴露后的类胡萝卜素含量，可以观察到，在暴露于3 Wm的细胞中^－2， UV-B在所有暴露时间间隔下都能增强类胡萝卜素的产生。与对照组相比，暴露10、15、30、45和60分钟后，类胡萝卜素含量分别增加了6.5%、13.3%、30.5%、26.6%和21.7%。在暴露于5w。m的细胞中也是如此^－2UV-B辐射最初促进了类胡萝卜素的产生。然而，与对照组相比，暴露60分钟后，类胡萝卜素含量下降了15.5% (图4)．

总蛋白

紫外线- b暴露导致总蛋白质减少。在3 Wm和5 Wm 60 min后，降低率分别比对照组低86.7和53.9%^－2,分别。暴露于3和5 Wm^－2除1 W m外，UV-B对总可溶性蛋白均有显著影响^－2/30分钟，对总蛋白无显著影响(图5)．

总碳水化合物

暴露的c .寻常的对UV-B辐射的影响显示总碳水化合物含量下降。UV-B照射细胞暴露于3和5 Wm后60min^－2碳水化合物含量分别比对照降低29.0和64.0% (图6)．

总脂质

在小球藻寻常的，对照组(无紫外线照射)总脂含量为138 mg/L, 15 min后为5 W m^－2在紫外线B照射后，脂质含量随之下降(图7)．

对暴露在UV-B辐射下的实验微藻进行筛选，以发现通常在细胞内积累的MAA (Mycosporine like氨基酸)等化合物。MAAs是众所周知的紫外线吸收/屏蔽化合物，可提供对UV-B辐射的光保护。对UV-B处理的藻类进行分光光度分析，发现MAA化合物的存在。这方面的进一步研究也正在进行中，用于UV-B筛选化合物的定性筛选。在本研究中，在332 nm处发现了MAAs的紫外吸收带小球藻寻常的（图8)．

讨论

到达地球表面的太阳UV-B辐射使生态系统发生了显著变化。UV-B对微藻的不良影响也很大，因为它们是微藻生长的基础食物水生系统中的链[18］．正如在高等植物中发现的那样，UV-B辐射胁迫对微藻的有害影响包括抑制光合作用、破坏DNA [19]、蛋白质及脂质[19]，生成氧自由基[20.]和对营养吸收的抑制[21］．UV-B诱导两种藻类细胞发生结构变化[22］．在本研究中，结果表明UV-B对紫杉树的生长和生存有明显的抑制作用小球藻寻常的随着UV-B强度和暴露时间的增加，抑制作用增强。与我们的结果一致，模拟UV-B辐射在3至5 Wm的辐照度下的有害影响^－2已在几种藻类[23］．

还清楚地表明，UV-B照射在5 Wm^－2叶绿素a和叶绿素b含量显著降低小球藻寻常的．然而，5 Wm的影响^－2比3 Wm^－2UV-B辐射。这些结果与在Ulva [24，25］．UV-B暴露可引起光合色素的损失，并降低其表达基因参与光合作用[26］．在各种生理过程中，光合作用是紫外线辐射的潜在主要目标，因为光合作用可能产生多种影响[27］．UV-B对光合色素的破坏作用可能是由于UV-B照射引起的脱色，也可能是由于UV-B对光合色素的破坏酶参与叶绿素生物合成[17］．

结果显示，小剂量的UV-B辐射刺激细胞外碳水化合物的合成小球藻寻常的．然而，高剂量抑制细胞外碳水化合物的产生。前期的研究结果与UV-B照射对赤霉胞外多糖产生影响的研究结果一致[28］．

结果还表明，UV-B照射(1,3,5 W m^－2)在低UV- b剂量下显著增加类胡萝卜素，这与藻类细胞合成吸收紫外线波长的色素是对抗UV- b辐射的重要保护机制的报道相似[29-31］．这些包括类菌孢素氨基酸(MAAs)，主要存在于细胞的外围，从而防止UV- B辐射进一步渗透到细胞。

MAAs是环己酮亚氨基羰基衍生物的水溶性小分子，最大吸收波长在280 ~ 360 nm之间。Scytonemin是一种不溶于水的分子，存在于蓝藻细胞周围的胞外粘液鞘中，也被认为是一种光保护化合物[32］．在阿根廷海域发生鞭毛藻赤潮期间，MAAs的数量和多样性也很高。同样，在Gymnodinium cfu . aureolum中也显示在活的有机体内而且在体外在紫外区域的吸收，最大值在334 nm，这与本研究相似[33］．

结论

这表明，微藻已经进化出了保护自己免受紫外线- b伤害的方法——要么是通过产生筛选化合物小球藻寻常的．具有商业意义的微藻对UV-B辐射的抗性，即小球藻寻常的有可能成为生物柴油的来源。考虑到国际油价的暴涨，有必要评估藻类在生物柴油等能源生产方面的潜力。在这种藻类中合成生物柴油分子的碳分配仍有待探索。

确认

作者感谢印度政府科技部为本研究提供的财政支持。

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